1、目的:非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty livcr disease,NAFLD)是指除外酒精和其他明確的肝損傷因素所致的,以彌漫性肝細(xì)胞大泡性脂肪變?yōu)橹饕卣鞯呐R床病理綜合征,包括單純性脂肪性肝病以及由其演變的脂肪性肝炎和肝硬化[1-2]；目前,NAFLD的具體發(fā)病機(jī)制并不是十分清楚,是一種代謝應(yīng)激性肝損傷,其與胰島素抵抗和遺傳易感性密切相關(guān)[3-5]。本實(shí)驗(yàn)旨在通過改良高脂飲食建立非酒精性脂肪性肝病大鼠模型,

2、通過時(shí)間點(diǎn)的變化來研究磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol3-kinase,PI-3K)、二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶2(AcylCoA:DiacylgycerolAcyltransferase-2,DGAT2)、蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)的亞型PKC-ε在脂肪肝的表達(dá)量的變化,從而進(jìn)一步探索NAFLD的發(fā)病機(jī)制。
　　 方法:健康成年雄性Spague-Dawlay(SD)大鼠48只(1

3、50-180g),按隨機(jī)表法隨機(jī)分為2組,設(shè)立4、8、12周高脂喂養(yǎng)模型組(H組),并設(shè)立同時(shí)相正常喂養(yǎng)組(N組)作為對(duì)照,每組8只。正常飲食組給予基礎(chǔ)飼料(瀘州醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供),模型組給予高脂飲食(即制備的改良高脂飼料:膽固醇含2％,膽酸鈉含0.5％,丙硫氧嘧啶含0.2％,蔗糖含5％,豬油含10％,基礎(chǔ)飼料含82.3％[6]),兩組飲料均為自來水,自由飲用。造模4、8、12周末時(shí)分別處死對(duì)照組及模型組大鼠各8只,心臟采血,測(cè)量大

4、鼠的血清轉(zhuǎn)氨酶(AST、ALT)以及膽固醇(TC),以觀察大鼠非酒精性脂肪性肝病模型肝脂變進(jìn)展；然后迅速取出肝臟稱肝濕重,計(jì)算肝指數(shù):肝濕質(zhì)量/體質(zhì)量×100％。取肝組織標(biāo)本,制備石蠟切片,行蘇木精-伊紅(HE)染色觀察肝組織光鏡下的病理改變,并觀察肝臟脂肪變程度；免疫組織化學(xué)法檢測(cè)PKC-ε在肝組織中的表達(dá)情況；實(shí)時(shí)熒光定量PCR法(real-time quantitativePCR)檢測(cè)肝臟PI-3K mRNA以及DGAT2 mRN

5、A的表達(dá)。計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((x)+SD)表示,采用t檢驗(yàn),組間比較采用方差分析,方差齊者采用單因素方差分析,方差不齊者采用H檢驗(yàn),比較模型組與對(duì)照組及模型組間在血清學(xué)、病理學(xué)等指標(biāo)的差別,P<0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果:1.血清生化學(xué)指標(biāo):(1)肝功能和血脂:模型組AST、ALT和TC隨著造模時(shí)間的逐漸延長(zhǎng)與正常組相比明顯升高。2.病理學(xué)觀察:(1)肝臟大體觀察:肉眼可見大鼠正常組肝臟呈鮮紅色；與之比較模型組肝臟

6、肉眼觀即可出現(xiàn)肝臟顏色變黃,有油膩感,肝臟體積增大。(2)組織學(xué)觀察:正常組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)清晰,肝竇網(wǎng)狀纖維疏松。模型組4、8、12周動(dòng)物肝組織出現(xiàn)中至重度肝細(xì)胞脂肪變性,隨造模時(shí)間延長(zhǎng)脂肪變程度、氣球樣變以及纖維化程度逐漸加重,均高于對(duì)照組(P<0.05)。NAFLD病理改變中脂肪變性、肝細(xì)胞氣球樣變、小葉內(nèi)炎癥和纖維化發(fā)生普遍,并且脂肪變性與小葉內(nèi)炎癥、纖維化及肝細(xì)胞氣球樣變程度間呈正相關(guān)關(guān)系。3.PKC-ε免疫組織化學(xué)法的表達(dá):對(duì)

7、照組肝臟中呈散在分布,胞漿內(nèi)著色,弱陽(yáng)性。模型組PKC-ε在肝臟的細(xì)胞膜及細(xì)胞漿內(nèi)呈明顯的棕黃色陽(yáng)性表達(dá),隨著時(shí)間的延長(zhǎng),棕黃色的陽(yáng)性表達(dá)逐漸加深,并呈片狀分布,分布的范圍越廣,且表達(dá)量較正常對(duì)照組明顯增加。造模4周時(shí),肝細(xì)胞著色較正常組深,散在分布。造模8周時(shí),棕黃色顆粒在陽(yáng)性細(xì)胞的表達(dá)加深,分布較密集,陽(yáng)性細(xì)胞增多。造模12周時(shí),可見陽(yáng)性細(xì)胞增加,棕黃色表達(dá)進(jìn)一步加深,呈彌漫、大片分布。4.熒光定量PI-3K mRNA及DGAT2

8、mRNA在肝組織的表達(dá):PI-3K mRNA在模型組隨著脂肪變、纖維化、炎癥程度的加重,表達(dá)量逐漸減少且模型組各組之間與正常組表達(dá)量相比明顯減少(P<0.05);DGAT2 mRNA在模型組隨著肝脂肪變、纖維化、炎癥程度的加重,表達(dá)量逐漸上升且模型組各組之間與正常組表達(dá)量相比呈顯著增加(P<0.05)。
　　 結(jié)論:1.PI-3K(p85a)mRNA表達(dá)隨著NAFLD的肝脂肪變程度加重,其表達(dá)量逐漸降低,PI-3K(p85a)m