1、目的：從臨床標(biāo)本中分離培養(yǎng)肺炎嗜衣原體（Chlamydophila pneumoniae, Cpn）并對其進(jìn)行鑒定；以臨床株接種小鼠，觀察小鼠一般活動及肺部病理改變情況。為Cpn的相關(guān)實驗研究提供實驗材料。
　　方法：采集呼吸道感染患者的鼻咽拭子及肺泡灌洗液標(biāo)本；選取Cpn保守序列16srRNA特異性引物，PCR法初步篩選Cpn感染陽性標(biāo)本；將初篩陽性標(biāo)本處理后接種于Hep-2細(xì)胞，35℃，5％ CO2溫箱中培養(yǎng)72h；吉姆薩染色

2、、間接免疫熒光法對培養(yǎng)后產(chǎn)物進(jìn)行鑒定，顯微鏡下計算包涵體數(shù)；對鑒定為陽性的標(biāo)本進(jìn)行16srRNA保守序列PCR擴(kuò)增，根據(jù)測序結(jié)果進(jìn)行序列同源性比對和系統(tǒng)發(fā)育分析；取分離的Cpn臨床株以不同途徑攻擊BALB/c小鼠，對小鼠接種后一般活動及肺部病理切片進(jìn)行觀察與分析。
　　結(jié)果：從450例臨床標(biāo)本中初篩出Cpn感染陽性標(biāo)本15例；細(xì)胞培養(yǎng)法培養(yǎng)72h后經(jīng)吉姆薩和間接免疫熒光法鑒定為陽性2例；16SrRNA序列同源性比對和系統(tǒng)發(fā)育分析顯

3、示其與Cpn標(biāo)準(zhǔn)株存在較高同源性；鼻飼接種Cpn臨床株后的BALB/c小鼠的一般活動情況發(fā)生改變，肺部有Cpn感染的特征性病理改變。
　　結(jié)論：
　　1）成功分離培養(yǎng)出兩株Cpn臨床株，為Cpn相關(guān)研究提供了實驗材料；
　　2）成功建立Cpn感染的動物模型，為Cpn相關(guān)研究的開展提供了實驗依據(jù)。
　　目的：研究Cpn多態(tài)膜蛋白（polymorphic membrane proteins,Pmp）Pmp6和Pmp2

4、1的免疫活性，探討Pmp6和Pmp21重組蛋白在Cpn感染血清學(xué)診斷中的應(yīng)用價值。
　　方法：生物信息學(xué)方法篩選Pmp6和Pmp21優(yōu)勢抗原表位；以Cpn AR-39標(biāo)準(zhǔn)株基因組DNA為模板，PCR法擴(kuò)增Pmp6和Pmp21目的基因；將目的基因分別亞克隆至pGEX6p-2原核表達(dá)載體中，構(gòu)建重組質(zhì)粒；經(jīng)測序鑒定后轉(zhuǎn)化至E.coli BL-21中，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后SDS-PAGE和Western blot分析和鑒定表達(dá)產(chǎn)物；用GS

5、T?Bind?Resin純化樹脂純化重組蛋白；BCA法測定純化蛋白濃度；以純化的重組蛋白分別免疫BALB/c小鼠，制備多克隆抗體；建立間接 ELISA法，優(yōu)化條件后進(jìn)行可靠性和穩(wěn)定性試驗，分別檢測小鼠血清中特異性抗體效價，分析重組蛋白的免疫原性；用間接ELISA和Western blot法分析重組蛋白的免疫反應(yīng)性；間接ELISA法與Cpn IgG診斷試劑盒（Bio-Quant公司C.pneumoniae IgG ELISA Kits）平

6、行檢測120份臨床血清標(biāo)本，比較檢測結(jié)果，綜合評價兩種重組蛋白在Cpn感染臨床診斷中的應(yīng)用價值。
　　結(jié)果：軟件分析Pmp6和Pmp21的抗原表位，選擇Pmp6優(yōu)勢抗原表位編碼基因的448bp~1203bp位堿基序列（片段長度為756bp，編碼252個氨基酸）和Pmp21優(yōu)勢抗原表位編碼基因的154bp~885bp位堿基序列（片段長度為732bp，編碼244個氨基酸）；分別設(shè)計特異性引物，PCR法擴(kuò)增得到目的片段；構(gòu)建的重組質(zhì)粒經(jīng)

7、測序鑒定證實插入片段為目的基因，測序結(jié)果經(jīng)BLAST比對與Genbank上登錄序列完全一致；SDS-PAGE分析顯示，IPTG誘導(dǎo)重組工程菌分別表達(dá)出相對分子量（Mr）約為50kDa（Pmp6）和52kDa（Pmp21）的目的蛋白，在菌體細(xì)胞內(nèi)均主要以可溶性形式存在；經(jīng)GST?Bind?Resin純化后獲得了純度在95%以上的重組蛋白；以重組蛋白為包被抗原建立間接 ELISA法，檢測免疫小鼠血清中特異性GST-Pmp6和Pmp21 Ig

8、G抗體效價，其滴度分別達(dá)1:6400和1:12800以上；同時用該法對120份上呼吸道感染的病人血清進(jìn)行檢測，將重組蛋白間接ELISA法結(jié)果與美國Bio-Quant公司C.pneumoniae IgG ELISA Kits診斷試劑盒的檢測結(jié)果進(jìn)行比較，ELISA法與診斷試劑盒檢測血清標(biāo)本的符合率分別為為91.7%（Pmp6)和97.5%(Pmp21）。
　　結(jié)論：
　　1） GST- Pmp6與GST- Pmp21重組蛋白均