1、不孕不育是全世界關注的課題。目前每100對已婚夫婦中，就有10對夫婦存在不孕不育問題。其中男性因素占到了50％。也就是說，男性精子質量不佳，己影響到人類的繁衍生息。 該文把精子中具有編碼功能的序列作為重點，把精子的基因表達譜作為研究對象。 要研究精子的基因表達，首要的問題是提取到精子中表達的RNA。精子與體細胞不同，是單倍體細胞，處于分化的終末階段，因此，以前人們一直認為精子中無基因表達，精子基因分子生物學的研究也一直沒

2、有深入開展。直到最近幾年，KramerJ等人首先報道了在精子內檢測到了RNA的表達，此后MullerD等人先后改進了異硫氫酸胍/有機溶劑的抽提方法，并排除了各種可能造成DNA污染因素，自成人的精子中分離到了RNA，才證實了成熟精子中確實存在RNA的表達。隨著對精子分子生物學研究的不斷深入，精子中有基因表達也越來越得到人們的認同，如頂體中的水解蛋白酶(透明質酸酶，頂體素)和磷脂酶，線粒體中的琥珀酸脫氫酶，此外還有Na+、K+-ATP酶、酪

3、氨酸蛋白激酶、尿激酶、乳酸脫氫酶等等。這些發(fā)現(xiàn)和認識激發(fā)了人們進一步研究精子基因表達的濃厚興趣。 提取細胞或組織中的RNA，異硫氰酸胍法一直是傳統(tǒng)而經(jīng)典的方法，對大多數(shù)的細胞和組織都能得到良好的結果，但在提取精子中的RNA時，效果并不理想。 精子是單倍體細胞，比之體細胞，RNA的表達數(shù)相對少。作為分化末期狀態(tài)細胞，RNA的表達量可能也有所降低，所以總體而言，精子中的RNA量較正常體細胞低得多。 針對這種特殊的實驗

4、材料，該實驗對RNA的提取程序進行了探索。選擇了QAGEN公司開發(fā)的、針對小樣品量的RNA提取試劑盒——RNeasyMiniKit，來提取成年男性活力正常的精子RNA，取得了良好的效果。 對提取到的RNA在進行逆轉錄前需進行質量檢測，以確保沒有基因組DNA污染。應用常規(guī)的凝膠電泳檢測提取到的少量的精子RNA，無法在電泳結果中看到RNA中的三條核糖體RNA條帶，也無法根據(jù)常規(guī)的條帶間的灰度比值，來判斷RNA有無降解或存在DNA污染

5、。針對這個問題，該文應用了微流體芯片高壓凝膠電泳進行了質量檢測。在極少量的上樣檢測中(25ng)，發(fā)現(xiàn)了RNA中的三個核糖體RNA條帶，但與正常體細胞的RNA電泳圖譜不一致。在缺乏標準判斷指標的前提下，根據(jù)重復多次(13次)的實驗結果，提出了精子RNA電泳圖譜的基本形狀，及精子RNA質量評價的基本標準。 進而，該文將經(jīng)過質量檢驗的精子RNA逆轉錄為cDNA，應用馬文麗、鄭文嶺教授創(chuàng)建的限制性顯示技術，對cDNA進行了限制性酶切、

6、加通用接頭，用通用引物進行PCR擴增，將擴增產(chǎn)物作為模板，3，端延伸一個堿基的通用引物為分組引物進行了十組PCR分組擴增，并將十組PCR產(chǎn)物轉入大腸桿菌，經(jīng)涂板、挑克隆、鑒定、提取陽性質粒等操作，收集到了560個精子cDNA的片段，編號索引后-20℃保存?zhèn)溆谩?將質粒中保存的精子cDNA片段，根據(jù)質粒上的序列設計引物，擴增插入的精子cDNA片段。上述片段擴增芳達到足夠量后(2μg)用異丙醇純化，純化產(chǎn)物重溶于Milli-Q超純水

7、中，取出適量，加入50％DMSO，調整濃度為300ng/μl，在Corning的玻片上，以3-磷酸甘油醛(GAPDH)為陽性對照，HIV基因片段為陰性對照，50％二甲基亞砜(DMSO)為空白對照，每個探針重復打印三次，制作了精子表達譜基因芯片。 應用自制的精子cDNA芯片進行了兩個方面的研究。①驗證該文收集的精子cDNA探針的準確性和可信性；②對精子的基因表達進行了初步的研究。精子樣品按上述同樣的方法和操作程序進行限制性顯示實驗

8、操作，但在cDNA片段的兩端連接上了與探針序列不一樣的通用接頭2，再用相應的通用引物2擴增，避免雜交時，探針和待雜交樣品間都具有大約40bp的同源性片段，從而對雜交結果的準確性造成影響。經(jīng)此法制備的精子cDNA片段，用Cy3熒光物質標記后，與36×34的芯片陣列進行了單色雜交，雜交結果證實該文收集的精子cDNA探針具有較好的準確性和可信性，可進行進一步的雜交實驗和分析。進一步收集精子樣品和人的淋巴細胞，采用與單色雜交相同的方法和程序，制

9、備了Cy3標記的精子cDNA片段和Cy5標記的人淋巴細胞cDNA片段，與42×40的芯片陣列雜交。雜交結果提示，精子中已有大量的基因表達，并且在精子中與基因復制、轉錄和轉錄調控以及蛋白質的翻譯和降解等相關的基因表達基本屬于無差異表達類型或低表達類型，而與精子發(fā)生相關的基因、精子本身的特異性抗原等基因則顯著高表達，如人精子相關抗原4、精子發(fā)生相關基因2、DAZ3基因等。與能量生成密切相關的基因，如糖酵解相關基因表達上調，而與氧化磷酸化相關

10、的基因則表達下調，這與獲能前的精子主要依賴無氧酵解供能的生理特點相一致。此外，在表達的基因片段中，有2個探針與人直腸腺癌cDNA消減文庫中的基因高度同源，但功能未知，還有一些基因探針與NCBI的NR和EST數(shù)據(jù)庫比較，都未發(fā)現(xiàn)有同源性片段，推測是精子中特異表達的基因，已作為新EST向GeneBank進行了提交。 為進一步擴大研究精子細胞的基因表達譜，該研究應用了人全基因組寡核苷酸芯片(AgilentHuman1B基因芯片)，對正

11、常的睪丸組織與射精精子，以及正常與無活力射精精子的基因表達譜進行了研究。采用cRNA線性標記擴增技術對精子的mRNA進行線性擴增和標記。雜交后該文建立了正常精子基因表達譜，發(fā)現(xiàn)在待測的21073個基因中，正常精子兩次雜交共同檢測到表達的基因僅有2157個，包括目前已知的與精子的發(fā)生和活力相關的基因22個。精子基因表達譜的建立展現(xiàn)了經(jīng)射精獲得的精子內表達mRNA的全貌，為我們進一步研究精子內所進行的各種分子生物學及細胞生物學過程奠定了基礎

12、。正常精子與正常睪丸組織分別提取總RNA，純化為mRNA后經(jīng)cRNA線性標記擴增，并與人全基因組寡核苷酸芯片雜交，結果發(fā)現(xiàn)正常精子相對于睪丸組織而言共有67個基因表達上調，包括16個目前已知的與發(fā)育相關的基因，14個與精子發(fā)生、成熟及活力相關的基因等如TCFL5、HIST1H1T基因等。除此之外，這些表達上調的基因按照功能分類，還包括14個與配子發(fā)生相關的基因，13個與蛋白代謝及修飾相關的基因，11個與核苷、核苷酸、核酸代謝相關的基因，

13、10個與信號轉導相關的基因，8個與蛋白修飾相關的基因，6個與蛋白磷酸化相關的基因和6個與細胞內信號級聯(lián)放大相關的基因等。這些基因的篩出，為進一步研究在精子成熟過程中發(fā)揮重要作用的基因提供了依據(jù)。 正常精子與活力不足精子的基因表達差異分析發(fā)現(xiàn)活力不足的精子中表達上調的基因有69個，包括目前已知的與精子發(fā)育及活力明確相關的C1QBP、SEMG2、ABP1、SPATA5、SEMG1、USP25、CREM、GRP58、NM139073.

14、1共9個基因。表達下調的基因有116個，包括目前已知與精子發(fā)育及活力明確相關的基因MGC26706、CATSPER1、ODF1、PRKAR2A、ROPN1、RSHL1、CATSPER2、AF053356CDS3、TEKT3、GAPDS、TEKT2、DJ473B4共12個。篩選出的其余的差異基因初步認為都與精子活力不足的發(fā)生有關，當然確切的結論尚需進一步的研究確定。 綜上所述，該文通過提取精子的RNA，收集精子cDNA芯片探針，自