1、目的： 關節(jié)軟骨主要是由軟骨細胞及其周圍的外基質組成的無血管組織。關節(jié)軟骨損傷是骨科的較為常見的疾患，其損傷后自我修復能力很弱，至今軟骨缺損的修復仍無理想的方法。創(chuàng)傷、骨軟骨炎、骨性關節(jié)炎、髕骨軟化等均可引起軟骨以及軟骨下骨的損傷和（或）缺損。軟骨損傷的修復一直是骨關節(jié)外科的一個難題，目前對于輕度的軟骨損傷主要以保守療法為主，而晚期嚴重的軟骨損傷可引起嚴重的膝關節(jié)疼痛，畸形等，通常采用人工關節(jié)置換術為主。本課題采用組織工程技術，

2、體外分離骨髓間充質干細胞（bMSCs），用微團培養(yǎng)方法經過特定生長因子誘導生成軟骨細胞和成骨細胞后，將軟骨細胞、成骨細胞種植于三維多孔β—磷酸三鈣（β—TCP）生物陶瓷支架材料上置于生物反應器中復合培養(yǎng)，構建骨軟骨復合體，觀察細胞在支架材料上的黏附、伸展和增殖情況，并模仿馬賽克骨軟骨移植術用塑型良好的骨軟骨復合體修復動物軟骨缺損，觀察其修復情況，探討以β—TCP為載體建造組織工程化軟骨修復骨軟骨缺損的可行性。 材料和方法：

3、 1.取4—10月齡健康比格犬3只，無菌穿刺抽取髂骨骨髓6—7ml，Percoll分離法分離骨髓間充質干細胞，進行原代、傳代細胞培養(yǎng)。流式細胞儀鑒定。取第3代的bMSCs，根據滴加生長因子的不同，分為三組：Ⅰ組軟骨細胞誘導組，滴加軟骨細胞誘導液（組成：BMP—2200ng／ml，IGF—Ⅰ10ng／ml，轉鐵蛋白6．25ug/ml，地塞米松10—7M/L，維生素C50ug/ml）；Ⅱ組成骨細胞誘導組，滴加成骨細胞誘導液（組成：地塞米松

4、100nmol／L，β—甘油磷酸鈉10mmol/L，維生素C0．05mmol／L）；Ⅲ組空白對照組，未滴加任何誘導因子。三組中常規(guī)加入含10%胎牛血清的H—DMEM液，采用體外微團培養(yǎng)。倒置相差顯微鏡觀察細胞生長狀況，誘導培養(yǎng)14天后，軟骨細胞誘導組行MTT法觀察細胞增殖狀況，細胞培養(yǎng)上清液檢測糖胺聚糖的含量，免疫細胞化學檢測誘導細胞Ⅱ型膠原的分泌，以觀察bMSCs向軟骨細胞分化的情況；成骨細胞誘導組行堿性磷酸酶染色和礦化結節(jié)染色以觀察

5、bMSCs向成骨細胞分化的情況。 2.取經過誘導培養(yǎng)14天的bMSCs，經檢驗誘導成軟骨細胞和成骨細胞后，分別調整細胞濃度為5×106/ml，與β—磷酸三鈣（β—TCP）復合培養(yǎng)1天，置入生物反應器中培養(yǎng)21天，進行復合組織的病理形態(tài)學觀察；動物實驗備用。β—磷酸三鈣（β—TCP）及軟骨細胞—成骨細胞—β—磷酸三鈣支架復合體進行掃描電鏡觀察。以觀察β—TCP支架材料的結構、孔隙率；觀察軟骨細胞、成骨細胞在β—磷酸三鈣支架內黏附和

6、生長增殖情況。 3.取10—12月齡健康比格犬9只，在實驗犬的股骨滑車處鉆直徑4．5mm，深度4．5mm的骨軟骨缺損，深達軟骨下區(qū)。隨機分為3組：A組，作為實驗組，9只，左膝軟骨缺損處深層植入軟骨細胞—成骨細胞—β—磷酸三鈣復合體；B組，作為陰性對照組，9只，左膝軟骨缺損處植入軟骨細胞—β—磷酸三鈣復合體；C組，空白對照組，9只，左膝軟骨缺損處植入空白β—磷酸三鈣。分別于術后12、16周處死取材，進行大體和組織學觀察。

7、結果: 1.細胞形態(tài)學改變倒置相差顯微鏡觀察發(fā)現，原代細胞接種后1—3日可見少量細胞貼壁，呈短梭形。3日后可見細胞集落形成，7—8日廣泛集落形成。12—14日細胞形成單層。傳代細胞貼壁快，7—8日形成單層，細胞核大，胞漿內顆粒多。取P3代細胞進行微團誘導培養(yǎng)，加入細胞因子后，細胞生長加快，微團中央形成細胞團塊，邊緣呈漩渦狀生長。 2.加入細胞因子BMP—2（Ⅰ組）的MTT吸光度值、培養(yǎng)上清液中的糖胺聚糖（GAG）含量和Ⅱ

8、型膠原分泌均明顯高于對照組（Ⅲ組）。Ⅱ型膠原免疫細胞化學陽性的bMSCs胞漿染色為黃色或棕黃色。堿性磷酸酶（ALP）染色顯示成骨細胞胞質中陽性反應呈現灰黑色顆?；驂K狀沉淀；礦化結節(jié)染色表明成骨細胞可形成肉眼可見的白色礦化結節(jié)，常用茜素紅法染色，染料品種的不同，礦化結節(jié)呈顯不同的紅色。 3.電鏡觀察：掃描電鏡顯示β—磷酸三鈣（β—TCP）材料平均孔徑為400～600μm，孔隙率為75%±10%，氣孔溝通率達100%。復合材料顯示軟

9、骨細胞、成骨細胞在β—磷酸三鈣（β—TCP）支架上的黏附、伸展和增殖良好，可以見到細胞分泌的基質和細胞偽足的鉚固作用，表明支架材料具有良好的細胞親和性。 4.動物實驗結果 大體觀察：術后16周，實驗組缺損修復區(qū)組織與周圍關節(jié)軟骨相整合，軟骨缺損區(qū)被光滑白色半透明的組織覆蓋，與周圍軟骨組織外形無差異；陰性對照組缺損區(qū)修復組織與周圍軟骨部分整合在一起，光澤較差；空白對照組缺損處修復組織低凹，新生組織軟，無光澤，與周圍軟骨組織

10、區(qū)別明顯。組織學觀察：術后16周，實驗組缺損區(qū)軟骨厚度與正常軟骨組織接近，細胞排列出現明顯規(guī)律，表面層的軟骨細胞平行關節(jié)面排列，深層縱向排列，與透明軟骨組織相似，軟骨下骨形成，潮線基本恢復，與周圍正常軟骨連接較好。陰性對照組軟骨細胞排列不規(guī)則，中央修復區(qū)大部分為纖維組織修復?？瞻讓φ战M缺損區(qū)內主要為纖維組織。 結論： 1. bMSCs為軟骨組織工程理想的種子細胞。取材方便，Percoll分離法分離可以獲取大量骨髓間充質干

11、細胞，體外培養(yǎng)能夠保持其表形的穩(wěn)定性，易于傳代擴增，在一定誘導條件的培養(yǎng)下，可以分化為軟骨細胞和成骨細胞。 2. BMP—2在促進bMSCs細胞增殖和向軟骨細胞定向分化方面有顯著的作用，均明顯高于對照組，是目前誘導bMSCs向軟骨細胞方向分化的理想細胞因子。 3.三維培養(yǎng)方法是目前誘導bMSCs向軟骨方向分化的最理想的培養(yǎng)方法。 4. β—磷酸三鈣（β—TCP）支架是理想的軟骨組織工程支架材料。具有良好的孔隙率和