1、背景
　　 食管癌是人類常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率高、惡性程度高、致死率高、預后差是其主要特征。我國位于國際著名的“食管癌帶”上，發(fā)病率位于世界首位。由于食管癌起病隱匿，臨床特征不明顯，確診時往往已到中晚期，術后復發(fā)率高，導致5年生存率遠低于其他腫瘤。因此，食管癌的早期診斷亟待新的進展。
　　 食管癌是遺傳因素和環(huán)境因素共同作用導致的復雜疾病。食管癌從組織分型看，主要包括食管鱗狀細胞癌和食管腺細胞癌，歐美以食管腺細胞癌多

2、見，而我國以食管鱗癌為主，占食管癌患者的90%以上。發(fā)病類型上的差異說明遺傳因素對我國食管鱗癌高發(fā)起了重要作用。因此，從遺傳因素尋找食管鱗癌的早期診斷指標具有重要意義。
　　 單核苷酸多態(tài)性(Single Nucleotide Polymorphisms，SNPs)是DNA序列中單個核苷酸堿基的變異，是基因組中最常見的遺傳變異。由于穩(wěn)定的可遺傳性和與疾病的相關性，SNPs成為研究復雜疾病理想的遺傳標記之一。基于SNP的疾病關聯(lián)研

3、究主要有兩種策略：候選基因SNP關聯(lián)分析和全基因組關聯(lián)研究(Genome-Wide Associated Study，GWAS)。兩種策略各有利弊，候選基因SNP關聯(lián)分析必須假定致病基因，且篩選范圍局限；而GWAS規(guī)模巨大，需要大量的人力和物力，而且篩選到的陽性SNPs不易闡述其功能。因此，如何選擇與疾病相關的SNPs進行關聯(lián)分析，成為疾病遺傳易感性研究的關鍵問題。
　　 SNPs在基因組分布廣泛，根據(jù)其在基因組中發(fā)生位置不同，

4、分為基因間SNPs、基因編碼區(qū)SNPs、基因非編碼區(qū)SNPs。其中，位于基因調控區(qū)域的基因非編碼區(qū)SNPs，可以影響基因的轉錄或者轉錄后調控，稱為調控SNPs?；蚪M范圍內，轉錄因子結合區(qū)域SNPs是重要的調控SNPs，這些SNPs可能影響轉錄因子與靶基因的結合，從而調控基因的表達，成為SNPs研究的熱點。篩選轉錄因子結合區(qū)域SNPs作為遺傳標記，后期更容易闡明這些SNPs的功能及其與疾病關系。
　　 P53是迄今為止發(fā)現(xiàn)的最為

5、重要的腫瘤抑制因子之一，通過維持基因組穩(wěn)定性、介導細胞凋亡、抑制血管生成等途徑來避免機體腫瘤的發(fā)生。而P53種種抑癌活性的產(chǎn)生，是以其作為轉錄因子調控的眾多下游靶基因發(fā)揮作用為基礎的。如P53可以通過上調Bax的表達水平，同時下調Bcl-2的表達來促進細胞凋亡的發(fā)生；當細胞受到應激時，P53通過調控靶基因CDKN1A和GADD45A的表達，發(fā)揮細胞周期阻滯和基因組修復的功能。我們推測，P53與下游靶基因的結合調控區(qū)域出現(xiàn)的單核苷酸多態(tài)性

6、位點(SNPs)，不同等位基因與P53的結合活力可能存在差異，從而引起靶基因的表達水平不同，最終導致攜帶不同等位基因的個體對于腫瘤具有不同程度的易感性。因此，這些P53結合區(qū)域的SNPs有望成為新的腫瘤發(fā)病風險標記，為腫瘤的早期診斷提供靶標。
　　 目的
　　 本研究擬通過生物信息學挖掘，在基因組范圍內篩選轉錄因子P53結合區(qū)域內中國漢族人群存在的SNPs位點，進一步以SNPs所在基因功能為篩選標準，得到P53結合區(qū)域內

7、與腫瘤發(fā)生有關的SNPs；以重慶人群為對象，通過病例一對照研究，探究這些SNPs與食管鱗癌易感性的關系，并于后期擬對陽性SNPs位點進行功能研究，從而為食管鱗癌的早期診斷提供理論依據(jù)。
　　 方法與結果
　　 1、研究對象的篩選
　　 研究對象來自第三軍醫(yī)大學第一附屬醫(yī)院胸心外科住院治療的食管鱗癌患者和同期體檢人員，病例和對照均為長期居住于重慶地區(qū)的漢族人群，兩組在年齡、性別等人口學特征方面完全匹配，且不存在血緣

8、關系。病例和對照各選擇400例進行基因分型。
　　 2、SNPs位點的篩選
　　 從UCSC數(shù)據(jù)庫中篩選轉錄因子P53全基因組范圍內的的結合序列及包含的SNPs位點12301個，然后結合HapMap數(shù)據(jù)庫篩選P53結合區(qū)域內中國北京漢族人群中存在的SNPs位點2688個，并且成立擬研究的SNP庫。在Gene Ontology數(shù)據(jù)庫中篩選與腫瘤發(fā)生有關的基因，結合既往研究發(fā)現(xiàn)Bax、CDKNIA、GADD45A基因是P53

9、的靶基因，且與腫瘤發(fā)生相關，因此，我們從SNP庫中重點篩選這三個基因座位內的SNPs，在HapMap數(shù)據(jù)庫查找它們在中國漢族人群中的等位基因型頻率，把MAF≥5%的SNPs作為擬研究的SNPs。得到如下6個SNPs：rs1009316，rs3783468，rs681673，rs532446，rs762624，rs2395655。
　　 3、SNaPshot分型及HWE
　　 本研究采取多重SNaPshot方法對rs100

10、9316，rs3783468，rs681673，rs532446，rs762624，rs2395655等6個SNPs位點在400例病例及400例對照中進行基因分型，由于分型成功率與各SNPs位點的PCR效率及實驗操作誤差有關，最后成功進行分型的例數(shù)為病例331-390例，對照367-384例。采用哈代-溫伯格平衡(Hardy-Weinberg Equilibrium，HWE)檢驗，我們發(fā)現(xiàn)rs3783468、rs681673、rs532

11、446三個SNPs位點不符合HWE，不再進行進一步的關聯(lián)分析，而rs1009316、rs762624、rs2395655三個SNPs位點檢驗p值分別為0.240、0.258、0.297，均通過了HWE。
　　 4、rs1009316、rs762624、rs2395655在病例和對照中的基因型分布
　　 成功對rs1009316進行基因分型的病例為331例、對照為367例。其中病例中CC、CT、TT基因型分別為235例(7

12、1.0%)、96例(29.0%)、0例；對照中CC、CT、TT分別為304例(82.8％)、63例(17.2%)、1例。rs762624相對rs1009316成功分型樣本較多，病例和對照中CC、AC、AA分別為97例(26.9％)、204例(56.7%)、59例(16.4%)和143例(38.2%)、168例(44.9%)、63例(16.9%)。rs2395655在病例和對照中GG、AG、AA分別為141例(39.7%)、161例(45

13、.4％)、53例(14.9%)和113例(31.5%)、168例(46.8%)、78例(21.7%)。
　　 5、rs1009316、rs762624、rs2395655與食管鱗癌的關聯(lián)作用
　　 在共顯性、顯性、隱性、乘法、和超顯性5種遺傳模型下，分析rs1009316、rs762624、rs2395655與食管鱗癌發(fā)病風險的關系。rs1009316在除了顯性模型外的4種遺傳模型中均顯示與食管鱗癌的發(fā)病風險具有明顯相關

14、性，CC相對CT(共顯性模型)、CC相對CT+TT(隱性模型)、C相對T(乘法模型)均降低食管鱗癌的發(fā)病風險(OR值和95％CI分別為0.499，0.348-0.717；0.507，0.354-0.728；0.563，0.403-0.788)，在超顯性模型中，CT相對CC+TT增加食管鱗癌的發(fā)病風險(OR值為2.010，95% CI為1.400-2.886)，由于TT樣本幾乎為零，故可簡化為CT與CC的比較結果。
　　 rs76

15、2624在共顯性(OR(CC/AC)為0.559，950/0 CI為0.402-0.776)、隱性(OR為0.596，95% CI為0.436-0.814)、乘法(OR為0.800，95％ CI為0.650-0.985)、和超顯性模型(OR為1.603，950/0 CI為1.198-2.146)中均與食管鱗癌的發(fā)病風險相關聯(lián)，但在顯性模型中不存在這種關聯(lián)性(OR為1:033，95% CI為0.701-1.525)。
　　 rs2

16、395655在超顯性模型中p值為0.699，與食管鱗癌易感性不存在關聯(lián)作用。在共顯性、顯性、隱性、乘法中與食管鱗癌發(fā)病風險相關(p值分別為0.005、0.019、0.021、0.004)，其中在乘法模型中p值最小，且G等位基因相比A等位基因增加樣本對食管鱗癌的發(fā)病風險(OR值為1.364，95％ CI為1.104-1.685)。
　　 6、根據(jù)吸煙史對陽性位點進行分層分析
　　 rs1009316在無吸煙史和有吸煙史樣本

17、中，C等位基因相對T等位基因均表現(xiàn)出保護效應，p值為0.005和0.008，OR值和95％ CI分別為0.516(0.324-0.819)和0.484(0.282-0.833)；而rs762624的C等位基因僅在無吸煙史的樣本中降低食管鱗癌的發(fā)病風險(OR值為0.696，95％ CI為0.503-0.962)。對于rs2395655位點，在有吸煙史樣本中，G等位基因顯著增加樣本的食管鱗癌易感性(OR值為2.341，95% CI為1.72