1、肝細(xì)胞癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)是肝臟原發(fā)性惡性腫瘤，其發(fā)生和發(fā)展與調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化的生長(zhǎng)因子和轉(zhuǎn)錄因子有著極為密切的關(guān)系。同源盒蛋白家族中的造血細(xì)胞特異表達(dá)同源盒基因(hematopoietically expressed homeobox，Hhex)編碼的蛋白作為一種轉(zhuǎn)錄因子，不僅參與多種器官發(fā)育和分化的過(guò)程，而且對(duì)肝芽的形成以及肝系和膽系的分化都具有相當(dāng)重要的作用。成體肝臟中，Hhex僅在成熟

2、的肝細(xì)胞中表達(dá)，具有維持肝細(xì)胞分化的作用。最近有研究表明，多種組織惡性病變的發(fā)生都與Hhex異常表達(dá)有關(guān)，例如人類白血病的發(fā)生與Hhex的低表達(dá)有關(guān)，T淋巴細(xì)胞瘤的發(fā)生則與Hhex的過(guò)表達(dá)相關(guān)。但是，關(guān)于Hhex與肝細(xì)胞癌發(fā)生的相關(guān)研究較少。已有研究顯示，Hhex mRNA在高分化的肝癌細(xì)胞系表達(dá)量較高，在低分化的肝癌細(xì)胞系不表達(dá)。本研究旨在探討Hhex的表達(dá)與肝細(xì)胞癌發(fā)生、發(fā)展之間的關(guān)系，以期為揭示肝臟腫瘤發(fā)生的機(jī)制奠定基礎(chǔ)，并為肝細(xì)

3、胞癌的治療和診斷提供新的靶點(diǎn)。
　　 本研究在小鼠肝癌細(xì)胞系Hepa1—6中采用腺病毒轉(zhuǎn)染系統(tǒng)來(lái)介導(dǎo)Hhex表達(dá)，觀察Hhex對(duì)Hepa1—6細(xì)胞的體外生物學(xué)特性及體內(nèi)成瘤能力的影響，并在42例人肝細(xì)胞癌組織中分析了HHEX的表達(dá)與不同分化狀態(tài)的肝細(xì)胞癌間的關(guān)系，結(jié)果如下：
　　 一、Hhex能夠抑制Hepa1—6細(xì)胞的體外生長(zhǎng)和克隆形成率
　　 運(yùn)用攜帶Hhex基因的腺病毒載體(命名為Ad—Hhex)感染293

4、LP細(xì)胞后，通過(guò)RT—PCR和Western Blot的方法可以檢測(cè)到Ad—Hhex感染的Hepa1—6細(xì)胞中含有目的基因與蛋白，但是對(duì)照組沒(méi)有檢測(cè)到。光鏡觀察Ad—Hhex感染的Hepa1—6細(xì)胞變大，多核細(xì)胞率增多，核質(zhì)比降低。MTT法對(duì)生長(zhǎng)曲線的分析比較發(fā)現(xiàn)Hhex可以明顯抑制Hepa1—6細(xì)胞的增殖。檢測(cè)體外克隆形成率分析顯示Ad—Hhex感染的Hepa1—6細(xì)胞的克隆形成率明顯低于對(duì)照組。流式細(xì)胞分析也證明了Ad—Hhex感染

5、的Hepa1—6細(xì)胞的凋亡率多于對(duì)照組。以上結(jié)果表明Hhex對(duì)小鼠肝癌細(xì)胞系Hepa1—6的體外增殖具有抑制作用。
　　 二、Hhex可以誘導(dǎo)Hepa1—6細(xì)胞的部分分化并降低EpCAM陽(yáng)性率
　　 通過(guò)RT—PCR檢測(cè)Ad—Hhex感染的Hepa1—6細(xì)胞中的抑癌基因(如P53、Rb)表達(dá)上調(diào)，原癌基因(如c—Jun、Bc12)表達(dá)下調(diào)。肝系標(biāo)志(如ALB、GS、TAT、Pck1和Cypla2)和膽系標(biāo)志(CK7和CK

6、19)以及肝臟早期發(fā)育相關(guān)性基因(AFP和HNF4α)的表達(dá)均上調(diào)，結(jié)果顯示Hhex可以誘導(dǎo)Hepa1—6的部分分化，進(jìn)一步提示Hhex可以減弱Hepa1—6的惡變程度。同時(shí)，細(xì)胞免疫化學(xué)分析一個(gè)肝癌“干細(xì)胞”候選指標(biāo)EpCAM在Hepa1—6細(xì)胞中的表達(dá)，結(jié)果顯示Ad—Hhex感染的Hepa1—6細(xì)胞中EpCAM的陽(yáng)性細(xì)胞率低于對(duì)照組。
　　 三、Hhex抑制Hepa1—6細(xì)胞的體內(nèi)成瘤能力
　　 為了評(píng)估Hhex對(duì)體

7、內(nèi)腫瘤形成的影響，將Ad—Hhex感染的Hepa1—6和空病毒感染的Hepa1—6細(xì)胞(對(duì)照組)分別注入裸鼠腹部?jī)蓚?cè)。9天后，在注射部位發(fā)現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的腫瘤，但注射感染Ad—Hhex的Hepa1—6細(xì)胞部位的腫瘤生長(zhǎng)速度明顯慢于注射對(duì)照組部位生長(zhǎng)的腫瘤速度。11天后，注射對(duì)照組的部位發(fā)現(xiàn)明顯壞死、潰爛的組織，但注射Ad—Hhex感染的Hepa1—6細(xì)胞部位沒(méi)有出現(xiàn)壞死、潰爛的組織。13天后，對(duì)不同部位生長(zhǎng)的腫瘤計(jì)數(shù)，結(jié)果顯示注射Ad—Hh

8、ex感染的Hepa1—6細(xì)胞部位所生長(zhǎng)的腫瘤數(shù)量少于注射對(duì)照組部位生長(zhǎng)的腫瘤數(shù)量。
　　 四、在不同分化狀態(tài)的肝細(xì)胞癌中HHEX表達(dá)水平不同
　　 為了探求HHEX與不同分化狀態(tài)的肝細(xì)胞癌的關(guān)系，通過(guò)免疫組織化學(xué)的方法分析42例不同分化狀態(tài)人肝細(xì)胞癌中HHEX的表達(dá)情況。結(jié)果顯示HHEX在肝細(xì)胞癌的癌旁組織(n=19)與高分化肝細(xì)胞癌(n=8)的胞漿中高表達(dá)，在部分低分化肝細(xì)胞癌的胞漿中低表達(dá)或者不表達(dá)(n=13)，在少

9、數(shù)低分化肝細(xì)胞癌(n=2)的胞核中表達(dá)。該結(jié)果提示HHEX在胞漿中的表達(dá)可能與肝細(xì)胞癌的分化狀態(tài)具有正相關(guān)性。
　　 本研究通過(guò)腺病毒轉(zhuǎn)染系統(tǒng)使Hhex基因能夠在小鼠肝癌細(xì)胞系Hepa1—6中高效的表達(dá)；證明Hhex基因過(guò)表達(dá)可以使小鼠肝癌細(xì)胞系Hepa1—6惡變程度降低(生長(zhǎng)抑制、成熟的分子標(biāo)志表達(dá)增強(qiáng)，原癌基因標(biāo)志表達(dá)減少，抑癌基因標(biāo)志表達(dá)增強(qiáng)等)；人肝細(xì)胞癌免疫組織化學(xué)分析顯示HHEX在胞漿中的表達(dá)可能與肝細(xì)胞癌的分化程度