1、豬支原體肺炎(Mycoplasmal pneumonia of swine，MPS)即豬的喘氣病，由豬肺炎支原體(Mycoplasma hyopneumoniae，MHP)引起的一種常見的慢性呼吸道疾病，一旦感染MHP后常常會繼發(fā)感染別的呼吸道疾病很難被治愈，給養(yǎng)豬業(yè)造成很大的經(jīng)濟損失。對于該病的根治理論上是完全可行的，但是在實際的操作過程中基本無法實現(xiàn)。目前對該病的控制措施最有效的方法是接種疫苗。目前我國市面上的疫苗主要是滅活苗和弱毒

2、苗，滅活苗多為進口疫苗價格高昂成為了其在各大豬場部署的障礙，而我國國產(chǎn)的弱毒疫苗多為肺內(nèi)注射，操作復(fù)雜且不被大多數(shù)養(yǎng)殖戶所接受同樣影響了其在個大養(yǎng)殖場的部署。鑒于此，本課題以豬肺炎支原體RM48疫苗株為研究對象，并對弱毒苗的佐劑進行篩選，旨在驗證MPS的氣霧免疫的可行性以及篩選出合適的疫苗佐劑。具體的實驗分為以下的三個步驟實施：
　　1．霧化對RM48疫苗株的影響及霧化器的篩選
　　分別使用購買的超聲霧化器和壓縮空氣霧化器在

3、無菌實驗室中對 RM48疫苗株進行霧化，無菌保存?zhèn)溆?。使用CCU法對收集到的疫苗進行支原體計數(shù)，并設(shè)立未霧化對照組。在生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12d后最后一瓶不再變色。結(jié)果顯示超聲和壓縮空氣霧化組的活菌數(shù)均和對照組無差別，說明霧化對RM48疫苗株并無太大損害。
　　通過比對兩種霧化器的霧化速度、霧化后氣霧的粒徑以及噴射距離后選擇了壓縮空氣霧化器作為噴霧免疫的霧化器。
　　2．利用家兔模型評價各種佐劑對豬支原體肺炎活疫苗的免疫增強作用

4、以及活疫苗噴霧免疫的可行性
　　佐劑的初步篩選及用量確定：將事先準備并配制好的黃芪多糖、天蠶素、板藍根+烏梅黃酮、CPG、天冬提取物佐劑按一定的濃度與RM48活疫苗混合稀釋，分別室溫下放置30min、1h和2h進行CCU活性計數(shù)看佐劑對活疫苗的毒性。結(jié)果顯示板藍根+烏梅黃酮對疫苗的活性影響較大棄用。其余佐劑對活疫苗基本無毒性作用。天蠶素和CPG的用量由實驗室提供分別為20μg/頭和10μg/頭。通過活性計數(shù)實驗確定黃芪多糖和天冬提

5、取物的用量為1mg/頭和5mg/頭。
　　家兔免疫后體內(nèi)疫苗株的PCR檢測：在免疫后第7d和14d每組分別剖殺一只兔子取肺臟、脾臟和肝。研磨處理后提取DNA然后進行PCR實驗檢測體內(nèi)疫苗株分布。結(jié)果顯示在第7d肺內(nèi)的PCR結(jié)果為陽性，其他組織均為陰性，第14d只有一組的肺呈弱陽性。
　　免疫后體內(nèi)細胞因子及抗體的檢測：于首次免疫后第7d、14d、21、28d分別取兔鼻拭子和血液，處理后用事先買好的試劑盒分別測定IL-4、IF

6、N-γ和SIgA，結(jié)果顯示各佐劑組均能誘導(dǎo)兔子產(chǎn)生高水平的細胞免疫、體液免疫以及黏膜免疫水平，其中尤其以CPG佐劑組最高。
　　3．用噴霧的方式對仔豬進行免疫
　　在本動物試驗研究中，實驗分為天冬提取物噴霧免疫組、CPG噴霧免疫組、黃芪多糖噴霧免疫組、天冬提取物噴霧免疫組、肺內(nèi)注射無佐劑組、無佐劑噴霧免疫組和對照組。分別在免疫前測定每組四只初生仔豬的體重，并在免疫后7d、14d、21d和28d采鼻拭子并測體重。用試劑盒測定鼻