1、目的：復(fù)蘇傳代培養(yǎng)大鼠主動脈平滑肌細(xì)胞(Smooth muscle cell，SMC)，研究不同濃度的銀杏葉提取物(Extract of gingko biloba，EGb)孵育誘導(dǎo)大鼠主動脈SMC中血紅素氧合酶-1(Heme oxygenase-1，HO-1)表達(dá)的量效關(guān)系(誘導(dǎo)組實(shí)驗(yàn))，并初步探索EGb誘導(dǎo)HO-1表達(dá)的分子機(jī)制(阻斷組實(shí)驗(yàn))。 方法： 1．細(xì)胞培養(yǎng)(cell culture)：配置好細(xì)胞培養(yǎng)所需的各

2、種液體后，復(fù)蘇大鼠主動脈SMC細(xì)胞株第3代(Passage 3，P3)，24h后可見SMC貼壁說明復(fù)蘇成功，繼續(xù)傳代培養(yǎng)至第6代(P6)。 2．預(yù)處理：當(dāng)SMC生長密度達(dá)到80％左右時(shí)對其進(jìn)行預(yù)處理，即使用含1％胎牛血清的培養(yǎng)基孵育24h，使細(xì)胞生長同步化。 3．EGb誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)：(1)實(shí)驗(yàn)分組：將25瓶SMC隨機(jī)分為5組，每組5瓶，用不含胎牛血清的培養(yǎng)基孵育。(2)同時(shí)用微量加樣器將EGb分別加入這5組SMC中，使其濃度

3、分別達(dá)到0、50、100、200、400μg/ml，在孵箱中孵育8h。 4．裂解細(xì)胞提取蛋白：在每瓶SMC中加入細(xì)胞裂解液300μl，置于冰上經(jīng)振蕩器充分振蕩裂解1h，高速低溫離心機(jī)中離心取上清蛋白。 5．蛋白免疫印跡法(Western blot)檢測HO-1蛋白：BCA法測蛋白含量、聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)、考馬斯亮藍(lán)染色觀察蛋白條帶、電轉(zhuǎn)移(electrotransfer)、封閉PVDF膜、免疫反應(yīng)(加

4、入一抗即小鼠抗大鼠HO-1單克隆抗體和二抗即辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗小鼠IgG抗體)、ECL法免疫熒光顯像。 6．圖像分析：將Western blot結(jié)果掃描傳送至計(jì)算機(jī)，用Image-Pro Plus圖像分析軟件系統(tǒng)對HO-1條帶進(jìn)行分析，以HO-1條帶灰度值代表HO-1的表達(dá)量，分析HO-1的表達(dá)水平和EGb的最適濃度。 7．放線菌素D(Actinomycin D，ActD)阻斷實(shí)驗(yàn)：再次培養(yǎng)5組大鼠主動脈SMC第6

5、代，每組5瓶，預(yù)處理后用無血清培養(yǎng)基孵育的同時(shí)按A-E組進(jìn)行實(shí)驗(yàn)分組后孵育。A組：Blank control(空白對照組)8h；B組：EGb最適濃度8h；C組：DMSO 5μl(溶劑)8h；D組：ActD 4＃m(DMSO 5μl)8h；E組：ActD 4μm(DMSO 5μl)30min，再加入最適濃度的EGb共同孵育8h(dimethyl sulfoxide，DMSO，二甲亞砜)，再次采用Western blot法分析HO-1條帶變

6、化。8．統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：組間差異先用單因素方差分析，再用q檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩比較。 結(jié)果： 1．細(xì)胞形態(tài)學(xué)： (1)復(fù)蘇后的SMC貼壁生長后以梭形為主，部分呈多角形和帶狀，單核、核大，逐漸呈集落狀分布趨勢。生長6-7d后，SMC不斷增多，互相融合，密集排列呈漩渦狀、峰谷狀或平行狀。 (2)預(yù)處理前后和誘導(dǎo)前后比較看來，SMC形態(tài)未見明顯變化，但由于胎牛血清濃度下降，細(xì)胞生長速度較之前變慢。 2．EGb誘導(dǎo)實(shí)

7、驗(yàn)組：(1)電泳條帶分析：空白對照組中HO-1有微量基礎(chǔ)表達(dá)，顯影最淺；EGb誘導(dǎo)大鼠主動脈SMC的HO-1蛋白電泳條帶顯影隨EGb濃度增加(50、100、200μg/ml)而加深，并且在EGb濃度為200μg/ml時(shí)蛋白電泳條帶顯影最深，在400μg/ml時(shí)顯影反而轉(zhuǎn)淺。(2)灰度值分析：隨EGb濃度的增加，HO-1表達(dá)增加，各組之間差異明顯(P＜0.01)；在EGb濃度200μg/ml孵育8h的情況下HO-1的表達(dá)達(dá)到峰值，隨后HO

8、-1的表達(dá)有所下降。 3.ActD阻斷實(shí)驗(yàn)組： (1)電泳條帶分析：A-E組中條帶顯影程度各有不同，從條帶深淺上看由淺到深依次為D、A和C(大致相同)、E、B。 (2)灰度值分析：灰度值大小和肉眼所見顯影程度一致，其中除了A組和C組之間的差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義之外(P＞0.05)，其余各組之間差異顯著(P＜0.01)。A組為空白對照組，HO-1有一定基礎(chǔ)表達(dá)；B組為最適濃度200μg/ml的EGb誘導(dǎo)，HO-1的灰度

9、值為最大；C組與A組HO-1灰度值差異不大，提示溶劑DMSO對HO-1的表達(dá)幾乎是沒有影響的；D組與A組HO-1灰度值差異顯著，提示ActD對HO-1的基礎(chǔ)表達(dá)就已經(jīng)有抑制作用； E組與B組HO-1灰度值差異顯著，提示ActD對EGb誘導(dǎo)的SMC中HO-1表達(dá)具有阻斷作用。 結(jié)論： 1．EGb可以誘導(dǎo)大鼠主動脈SMC中HO-1表達(dá)，并且這種表達(dá)具有量效關(guān)系，即隨EGb濃度增加HO-1蛋白表達(dá)增加，且在EGb濃度達(dá)200μ