1、第一部分目的：旨在探討質(zhì)粒介導(dǎo)的短發(fā)夾狀RNA(shRNA，shorthairpinRNA)對人呼吸道粘膜下腺細胞(SPC-A1)水通道蛋白5(aquaporin5，AQP5)表達的抑制。 方法：用免疫熒光雙標法檢測AQP5和MUC5AC在SPC-A1細胞上的表達。構(gòu)建能在哺乳動物細胞內(nèi)表達shAQP5重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染SPC-A1細胞。用熒光定量PCR檢測mRNA的表達，用FACS和Western雜交檢測蛋白表達。 結(jié)果：

2、AQP5和MUC5AC在SPC-A1上均有表達。與未轉(zhuǎn)染組(Con)和無關(guān)轉(zhuǎn)染組(shNeg)比較，shAQP5組細胞AQP5mRNA表達在轉(zhuǎn)染后l、2天明顯降低，3—7天mRNA水平有輕度回調(diào)，而蛋白的明顯抑制出現(xiàn)在轉(zhuǎn)染后第5天。 結(jié)論：質(zhì)粒介導(dǎo)的短發(fā)夾RNA(shRNA)可有效抑制人呼吸道黏膜下腺細胞膜AQP5的表達，AQP5蛋白水平的抑制滯后于mRNA水平。若能將RNA干擾用于AQPs的其它亞型將拓展AQPs生理功能的研究

3、。 第二部分目的：shRNA介導(dǎo)的AQP5的抑制是否影響SPC-A1細胞滲透壓驅(qū)動的水跨膜通透性。 方法：細胞分3組即Con組，shNeg組，shAQP5組。用標記胞漿的熒光染料Calcein-AM負載SPC-A1細胞，激光共聚焦顯微鏡實時監(jiān)測不同滲透壓溶液灌流時的熒光變化曲線，根據(jù)公式計算各組滲透壓驅(qū)動的水通透系數(shù)(Osmoticwaterpermeabilitycoefficient，Pf)。將細胞較長時間置于低滲液

4、中，觀察各組細胞調(diào)節(jié)性體積收縮(Regulatedvolumedecrease，RVD)現(xiàn)象的異同。 結(jié)果：用5個系列梯度的Calcein-AM負載細胞多次灌流實驗均未觀察到SPC-A1細胞的Calcein-AM淬滅現(xiàn)象。熒光強度與細胞體積的關(guān)系為：隨著滲透壓增高，細胞體積縮小，熒光強度增強；滲透壓降低，細胞體積增大，熒光強度減弱。shAQP5組細胞灌流高滲液后熒光強度的上升支較Con組和shNeg組緩慢，根據(jù)公式計算的Pf為0

5、．8×10～cm／s，與Con組比較下降49．4％。shAQP5組細胞的RVD時間明顯延長，最大回縮能力為85％，較Con組和shNeg組明顯降低。 結(jié)論：共聚焦顯微鏡可實時監(jiān)測熒光強度和細胞體積，是研究水跨膜轉(zhuǎn)運的理想方法。AQP5抑制后可明顯降低SPC-A1細胞滲透壓驅(qū)動下水的通透性，還可影響細胞在低滲環(huán)境中的調(diào)節(jié)性體積回縮能力。 第三部分目的：AQP5下調(diào)是否影響人呼吸道黏膜下腺細胞粘蛋白(MUC5AC)的合成和分

6、泌，若兩者確實存在某種調(diào)節(jié)關(guān)系，則進一步探討AQP5和MUC5AC之間調(diào)控的分子機制。 方法：構(gòu)建能在體內(nèi)表達針對AQP5的短發(fā)夾狀RNA(shAQP5)的重組質(zhì)粒。用G418篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染shAQP5的細胞克隆。MUC5ACmRNA及蛋白表達水平用Real-timePCR及Western雜交檢測。用ELISA法檢測3組細胞(Con，shNeg，shAQP5)上清及裂解液中MUC5AC的合成和分泌。用激光共聚焦顯微鏡檢測靜息及激發(fā)

7、狀態(tài)細胞內(nèi)鈣離子濃度的變化。3組細胞PKC及p-PKC水平差異用Western雜交檢測。 結(jié)果：G418處理1．5月后，篩出的5個穩(wěn)轉(zhuǎn)株經(jīng)PCR和測序鑒定證實插入序列已整合在細胞基因組上。pShAQP5瞬時轉(zhuǎn)染3～4天，MUC5ACmRNA分別增高120％和65．7％，ELISA顯示瞬轉(zhuǎn)第5天，MUC5AC的合成和分泌分別增加57．9％、85．3％。在5株穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞中fshAQP5-G1,G2,G3,A1,A5)MUC5ACm

8、RNA分別升高¨8％，165％，65％，123％和38％。ELISA檢測MUC5AC的合成和分泌分別增加59．156％及33—166％。shAQP5組的【Ca2+]i在靜息狀態(tài)與Con組無明顯變化，但pilocarpine激發(fā)下明顯增高。shAQP5組細胞PKC水平與Con組比較無明顯變化，但p-PKC的表達呈時間依賴性升高。 結(jié)論：AQP5抑制可上調(diào)SPC-A1細胞MUC5AC的合成和分泌，并可能是通過Ca2+一PKC信號通路