1、柑橘脈突病毒（Citrus vein enation virus，CVEV）是黃矮病毒科（Luteoviridae）豌豆耳突花葉病毒屬（Enamovirus）的一種正義單鏈RNA病毒，引起柑橘脈突病及木瘤病。目前，CVEV在西班牙、南非、澳大利亞、巴西、印度、美國(guó)、秘魯和土耳其等多個(gè)國(guó)家均有發(fā)生，在我國(guó)主要分布于浙江黃巖地區(qū)。由于該病毒能由多種蚜蟲傳播，因而具有一定的傳播流行風(fēng)險(xiǎn)。為保障我國(guó)柑橘產(chǎn)業(yè)安全，本研究在建立CVEV實(shí)時(shí)熒光定量

2、RT-PCR檢測(cè)方法的基礎(chǔ)上，構(gòu)建CVEV全長(zhǎng)cDNA克隆，分析其侵染性，并開展了CVEV基因沉默抑制子的鑒定，以期為CVEV的流行監(jiān)控、分子生物學(xué)及致病機(jī)理研究奠定基礎(chǔ)。所取得的主要研究結(jié)果如下：
　　1.CVEV實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)體系的建立
　　本研究通過設(shè)計(jì)特異性引物（EVqF4/EVqR4），優(yōu)化反應(yīng)條件，建立了CVEV實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)體系。該方法特異性良好；靈敏度較高（為常規(guī)RT-PCR的10

3、0倍）；標(biāo)準(zhǔn)曲線循環(huán)閾值與模板濃度呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.992，擴(kuò)增效率為101.8%；檢測(cè)組間和組內(nèi)變異系數(shù)均不超過2.85%，重復(fù)性較好，適用于檢測(cè)田間樣品。
　　2.CVEV在代代酸橙植株中的時(shí)空分布
　　應(yīng)用所建立的實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)體系對(duì)CVEV在代代酸橙中的時(shí)空分布進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明，CVEV在代代酸橙根中，無論春季、夏季或者秋季，其含量相對(duì)于其它部位最高，其次是嫩皮；另外，嫩葉、嫩皮和老皮中

4、CVEV含量在春季最高，春、夏、秋依次減少。
　　3.構(gòu)建CVEV全長(zhǎng)cDNA克隆及其序列分析
　　本研究建立了CVEV全基因組一步法RT-PCR擴(kuò)增體系，并成功獲得其全長(zhǎng)cDNA克隆36個(gè)。序列比對(duì)結(jié)果顯示，本研究所獲CVEV全長(zhǎng)基因組序列（命名為CVEV-XSH）與已報(bào)道的VE-1分離株基因組序列相似度最高，為98.61%；與豌豆耳突花葉病毒-1（Pea enation mosaic virus-1，PEMV-1）和紫花

5、苜蓿耳突病毒（Alfalfa enamovirus-1，AEV）曼菲蒂分離株序列進(jìn)行比對(duì)，其一致性分別為90.46%和90.26%，表明CVEV-XSH基因序列相對(duì)保守。根據(jù)全基因組序列構(gòu)建的進(jìn)化樹顯示，CVEV-XSH與VE-1、PEMV-1、AEV曼菲蒂分離株聚為一簇，與序列相似性分析結(jié)果一致。
　　4.CVEV全長(zhǎng)cDNA克隆侵染性分析
　　采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的本生煙接種法，對(duì)獲得的36個(gè)CVEV全長(zhǎng)cDNA克隆進(jìn)行了侵染

6、實(shí)驗(yàn)。生物學(xué)觀察以及分子檢測(cè)結(jié)果顯示未獲得侵染性克隆。為此，本研究進(jìn)一步設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，旨在發(fā)掘影響其侵染性的因素。首先，利用5'Race技術(shù)獲得末端序列，并對(duì)其變異情況進(jìn)行分析；結(jié)果顯示，CVEV5'端序列保守性極高，未發(fā)現(xiàn)變異存在。其次，采用與CVEV全長(zhǎng)cDNA克隆相同的方法構(gòu)建PVX全長(zhǎng)cDNA克隆，成功獲得PVX全長(zhǎng)cDNA侵染性克隆，說明本研究所用雙元表達(dá)載體pXT1以及構(gòu)建方法均有效。第三，為避免重組質(zhì)粒在大腸桿菌中存在不穩(wěn)定現(xiàn)

7、象而造成侵染失敗問題，本研究將CVEV全長(zhǎng)基因PCR產(chǎn)物與表達(dá)載體pXT1連接后，直接轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌初步得到4個(gè)陽性克隆，接種后經(jīng)分子檢測(cè)仍未篩選出侵染性克隆。第四，篩選其它草本寄主，即采用毒源葉片汁液摩擦接種豌豆、蠶豆、蕓豆、昆諾藜等草本植株，結(jié)果顯示均未表現(xiàn)出侵染性。綜上表明，CVEV全長(zhǎng)cDNA克隆侵染失敗并非5'末端序列變異、表達(dá)載體以及構(gòu)建方法所致，而針對(duì)重組質(zhì)粒在大腸桿菌中不穩(wěn)定以及寄主影響，或者其它原因造成的侵染失敗，還需進(jìn)一

8、步分析探究。
　　5.CVEV基因沉默抑制子的初步鑒定
　　本研究在克隆CVEV5個(gè)開放閱讀框（Open reading frame，ORF）編碼基因的基礎(chǔ)上，構(gòu)建其重組雙元表達(dá)載體，并利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的病毒微型復(fù)制子（p35miniBYV-eGFP）共浸潤(rùn)鑒定法開展了沉默抑制子鑒定試驗(yàn)。結(jié)果顯示：CP表達(dá)載體共注射本生煙植株各重復(fù)均出現(xiàn)綠色熒光，其熒光強(qiáng)度較負(fù)對(duì)照強(qiáng)，但與正對(duì)照HC-Pro相比較弱，說明CP具有一定的基因沉默