1、背景：
　　糖尿病足、壓力性潰瘍以及下肢靜脈潰瘍等慢性創(chuàng)面是臨床常見的疾病，不僅為患者帶來極大的痛苦和不便，也讓家庭及社會(huì)承受巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。以前，人們認(rèn)為慢性感染創(chuàng)面的細(xì)菌與生長(zhǎng)在培養(yǎng)液中的浮游細(xì)菌并無差異。但近20年的研究表明慢性創(chuàng)面的細(xì)菌以一種生物膜的形態(tài)生長(zhǎng)。生物膜感染的標(biāo)志性特點(diǎn)是很難被機(jī)體的免疫機(jī)制清除并且對(duì)抗生素等治療不敏感，形成組織反復(fù)的感染并且延遲愈合。細(xì)菌生物膜也被認(rèn)為是臨床慢性創(chuàng)面持續(xù)或反復(fù)感染、延遲愈合的主

2、要原因。
　　所以，進(jìn)行針對(duì)性治療生物膜感染的研究非常需要并具有重要意義。然而，迄今為止，關(guān)于治療生物膜慢性感染的具有實(shí)用性的研究非常有限。以往的研究主要集中于各種新型敷料的研制，但臨床研究表明敷料治療生物膜感染并未取得較好效果；探尋有效的分子靶點(diǎn)相關(guān)研究目前基本仍為體外實(shí)驗(yàn)，只有非常少的一部分研究進(jìn)行了活體實(shí)驗(yàn)。所以，臨床上慢性創(chuàng)面的治療仍是傳統(tǒng)的清創(chuàng)、沖洗以及抗生素治療，探尋一種有效的、并且具有實(shí)用性的生物膜慢性感染創(chuàng)面的治療

3、手段具有重要意義。
　　封閉負(fù)壓引流治療（VAC）自從1993年Fleischmann首次應(yīng)用以來，目前廣泛的應(yīng)用于臨床各種創(chuàng)面治療，而其治療慢性創(chuàng)面以及感染創(chuàng)面的療效尤其引人關(guān)注。目前VAC治療創(chuàng)面的機(jī)制主要?dú)w納為：增加局部血流、清創(chuàng)壞死、減輕水腫、釋放生長(zhǎng)因子（由于機(jī)械剪切力作用）以及減輕細(xì)菌負(fù)荷。雖然許多的研究證明VAC可以減輕創(chuàng)面的細(xì)菌負(fù)荷，但是從沒有研究將VAC針對(duì)性的應(yīng)用于治療生物膜感染這一慢性創(chuàng)面形成的主要原因。所以

4、，本研究通過體內(nèi)及體外實(shí)驗(yàn)針對(duì)性研究 VAC治療 PA生物膜感染創(chuàng)面的效果并對(duì)其機(jī)制進(jìn)行較深入的研究。實(shí)驗(yàn)共分以下四個(gè)部分：
　　方法與結(jié)果：
　　1.構(gòu)建兔耳銅綠假單胞菌生物膜感染創(chuàng)面模型。首先將銅綠假單胞菌在體外培養(yǎng)形成生物膜結(jié)構(gòu)，通過掃描電鏡、激光共聚焦顯微鏡、細(xì)菌計(jì)數(shù)等手段于1d、3d及5d觀察是否形成生物膜結(jié)構(gòu)。將成熟的生物膜培養(yǎng)片(5d)置于兔耳缺血?jiǎng)?chuàng)面，通過改良革蘭氏染色、掃描電鏡、透射電鏡以及圖像分析等方法，

5、觀察創(chuàng)面表面及深部細(xì)菌形態(tài)以及創(chuàng)面愈合情況。結(jié)果：銅綠假單胞菌在體外培養(yǎng)5 d形成成熟生物膜結(jié)構(gòu)，將培養(yǎng)片置于兔耳缺血?jiǎng)?chuàng)面3d后形成穩(wěn)定的生物膜感染創(chuàng)面并明顯延遲創(chuàng)面愈合。
　　2.應(yīng)用封閉負(fù)壓引流治療兔耳銅綠假單胞菌生物膜感染創(chuàng)面。實(shí)驗(yàn)分為生物膜對(duì)照組（CT組），清創(chuàng)對(duì)照組（DC組）以及負(fù)壓治療組（VAC組）。負(fù)壓治療組根據(jù)壓力不同分為-50mmHg組、-75mmHg組、-100mmHg組及-125mmHg組。各組分別于治療前、

6、治療后1、3、7、14及20天觀察創(chuàng)面愈合情況與細(xì)菌計(jì)數(shù)。CT組、DC組以及VAC(-75mmHg)組，于治療前、治療后3、6、9、及14天切取組織進(jìn)行病理學(xué)觀察、炎癥因子檢測(cè)、透射電鏡以及掃描電鏡觀察。結(jié)果：CT組及 DC組創(chuàng)面仍存在細(xì)菌生物膜結(jié)構(gòu)，VAC組創(chuàng)面細(xì)菌生物膜結(jié)構(gòu)破壞，細(xì)菌負(fù)荷明顯降低（P<0.05），創(chuàng)面愈合加快（P<0.05）。VAC組間比較，-75mmHg組效果最好。VAC(-75mmHg)組肉芽組織增殖速度及炎癥因

7、子表達(dá)水平高于清創(chuàng)對(duì)照組（均P<0.05）。
　　3.應(yīng)用封閉負(fù)壓引流治療銅綠假單胞菌生物膜的體外研究。實(shí)驗(yàn)分為 VAC(-75mmHg)組以及對(duì)照組（CT組），應(yīng)用VAC治療24h后，通過活菌計(jì)數(shù)、激光共聚焦顯微鏡及結(jié)晶紫染色法觀察創(chuàng)面活菌及生物膜數(shù)量，掃面電鏡觀察細(xì)菌形態(tài)，RT-PCR檢測(cè)exoS、exoT、pslA、pelA、rsmY、rsmZ、cbrA及crcZ基因表達(dá)變化。結(jié)果：與對(duì)照組相比，VAC治療后細(xì)菌數(shù)量無明顯差

8、異，生物膜成分明顯減少，細(xì)菌由生物膜形態(tài)向浮游形態(tài)轉(zhuǎn)化。PA急性感染狀態(tài)的標(biāo)志基因exoS與exoT表達(dá)明顯增加（P<0.01），慢性感染狀態(tài)的標(biāo)志基因pslA與pelA表達(dá)明顯下降。rsmY基因與rsmZ基因表達(dá)變化并無明顯差異，cbrA基因與crcZ基因表達(dá)明顯減低。
　　4. VAC通過Crc調(diào)控銅綠假單胞菌慢性感染向急性感染的轉(zhuǎn)化。對(duì)銅綠假單胞菌野生型菌株P(guān)AO1、crc突變株以及PAO12A（crc突變互補(bǔ)株）群集運(yùn)動(dòng)能

9、力、泳動(dòng)能力、綠膿菌素生成及生物膜形成量進(jìn)行檢測(cè)，觀察 Crc對(duì) PA的影響。將三種菌株培養(yǎng)的生物膜應(yīng)用 VAC進(jìn)行體外研究，觀察其生物膜形成量的變化以及exoS、pslA、cbrA及crcZ基因表達(dá)變化。結(jié)果：crc突變株群集運(yùn)動(dòng)能力、泳動(dòng)能力下降，綠膿菌素及生物膜生成增加，PAO12A與PAO1菌株結(jié)果較接近。應(yīng)用VAC干預(yù)后，PAO12A與PAO1生物膜形成量下降，crc突變株無明顯變化。crc基因突變株exoS、pslA、cbr

10、A及crcZ基因在VAC作用后無明顯改變，PAO1及PAO12A菌株 exoS基因表達(dá)增強(qiáng)，pslA、cbrA及crcZ基因表達(dá)下降。
　　結(jié)論：
　　將體外培養(yǎng)PA生物膜置于兔耳缺血?jiǎng)?chuàng)面可形成可靠、可重復(fù)的PA生物膜感染創(chuàng)面模型。單一清創(chuàng)手段并不能有效的清除PA生物膜感染創(chuàng)面內(nèi)細(xì)菌，而VAC治療可以加強(qiáng)創(chuàng)面局部中性粒細(xì)胞對(duì)細(xì)菌的吞噬而降低細(xì)菌負(fù)荷，并加快肉芽組織增殖而促進(jìn)PA生物膜感染創(chuàng)面的愈合。VAC單一的機(jī)械力作用并不