1、該研究采用免疫學(xué)技術(shù)、微生物學(xué)技術(shù)、蛋白質(zhì)技術(shù)等提取哈氏弧菌(Vibrioharveyi)主要保護(hù)性抗原外膜蛋白(Outermembraneprotein，OMP)和脂多糖(Lipopolysaccaride，LPS)，并分析了其結(jié)構(gòu)組成、免疫特性，探討培養(yǎng)及提取條件對(duì)OMP表達(dá)的影響；同時(shí)以大黃魚(yú)(Pseudosciaenacrocea)為試驗(yàn)對(duì)象，初步研究了保護(hù)性抗原對(duì)大黃魚(yú)免疫機(jī)能的影響。 主要結(jié)果如下： 1.分別采

2、用Sarkosyl法和改進(jìn)的酚水法提取V.harveyiOMP和LPS，利用SDS-PAGE、免疫印跡(Western-blot)試驗(yàn)分析其種類(lèi)組成和免疫反應(yīng)性。結(jié)果表明，3種血清型菌株來(lái)源的OMP主要由分子量為31kD-43kD的條帶組成，LPS主要條帶的分子量分布在20kD-120kD范圍內(nèi)；各菌株間LPS和OMP其SDS-PAGE圖譜差異明顯，但均存在共同條帶。吸附后的兔抗V.harveyi與3菌株來(lái)源的OMP的免疫印跡反應(yīng)存在差

3、異，分別表現(xiàn)出2條和1條免疫反應(yīng)帶；其中64kD反應(yīng)帶為3菌株共有；3菌株LPS的Western-blot結(jié)果有較大差異，分別表現(xiàn)了7條、2條和4條免疫反應(yīng)帶，其中31kDLPS為3菌株共有。 2.經(jīng)不同培養(yǎng)時(shí)間提取的LPS，在0h-48h內(nèi)產(chǎn)量逐漸增加；LPS電泳圖譜存在差異，30h時(shí)間點(diǎn)表現(xiàn)出更多的蛋白條帶及免疫反應(yīng)帶；所有時(shí)間點(diǎn)的LPS具有兩條共同的印跡帶(31kD和52kD)；各個(gè)時(shí)間點(diǎn)提取的OMP電泳圖譜無(wú)明顯變化，免

4、疫印跡顯示主要有一條共同反應(yīng)帶(64kD)。研究結(jié)果表明，培養(yǎng)時(shí)間對(duì)OMP的表達(dá)和免疫反應(yīng)性沒(méi)有明顯影響；而對(duì)LPS的產(chǎn)量、表達(dá)種類(lèi)和免疫反應(yīng)性均有較大的影響，培養(yǎng)30h左右提取的LPS免疫特異性最強(qiáng)。 3.在不同的培養(yǎng)及提取條件下，提取V.harveyi外膜蛋白，經(jīng)過(guò)SDS-PAGE分析發(fā)現(xiàn)，在不同培養(yǎng)時(shí)間、不同培養(yǎng)方式、不同pH值和無(wú)Fe培養(yǎng)基條件下提取的OMP電泳圖譜無(wú)明顯差異，主要條帶為74kD、42kD、40kD、37

5、kD、34kD。不同培養(yǎng)溫度下提取OMP圖譜有差異，差異不大。利用4種方法提取OMP，用蛋白酶抑制劑PMSF提取OMP，圖譜條帶最多；SDS提取的OMP圖譜條帶最少且不清晰；而Sarkosyl法與TritonX-100相比，差異并不明顯，TritonX-100抽提的OMP高分子量區(qū)域條帶較多。結(jié)果表明，提取OMP的最適宜細(xì)菌培養(yǎng)條件和提取方法為：培養(yǎng)基pH值6.5-7.6，振蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度25℃-34℃，培養(yǎng)時(shí)間24h-36h，提取方

6、法采用Sarkosyl法。 4.采用代表不同血清型的3株V.harveyi菌株，分別制備LPS、OMP和福爾馬林滅活FKC，作為免疫原，注射接種大黃魚(yú)，免疫接種不同時(shí)間后，測(cè)定受免魚(yú)血清中凝集抗體效價(jià)、血清溶菌酶活性和血液白細(xì)胞吞噬活性，28d后測(cè)定免疫保護(hù)力，結(jié)果表明，3種抗原對(duì)大黃魚(yú)均有較強(qiáng)的免疫原性。免疫組血清凝集抗體效價(jià)逐漸增高，28d時(shí)最高；溶菌酶活性21d達(dá)到峰值，隨后逐漸下降；白細(xì)胞吞噬活性7d后迅速增高，14d后

7、緩慢升高，21d達(dá)峰值，隨后下降。受免后7d、14d、21d、28d，各組之間，免疫組大黃魚(yú)各項(xiàng)免疫指標(biāo)明顯高于對(duì)照組；FKC能夠誘導(dǎo)受免魚(yú)產(chǎn)生最高凝集抗體效價(jià)，LPS、OMP組凝集抗體效價(jià)低于全菌(FKC)組，而免疫保護(hù)率檢測(cè)結(jié)果則表明，LPS、OMP組的免疫保護(hù)率卻明顯地高于FKC組，各組間免疫保護(hù)率大小順序?yàn)長(zhǎng)PS組＞OMP組＞FKC組＞＞對(duì)照組。LPS和OMP免疫組能夠獲得更好的保護(hù)效果，提示了LPS和OMP是V.harveyi