1、研究背景:
　　 腦卒中是嚴(yán)重危害人類(lèi)健康的常見(jiàn)病、多發(fā)病,除引起多種軀體功能障礙外,還出現(xiàn)不同程度的認(rèn)知和語(yǔ)言功能障礙,常導(dǎo)致產(chǎn)生一系列感情行為的變化等各種心理問(wèn)題,其中抑郁是腦卒中后常見(jiàn)的心理障礙,稱(chēng)之為腦卒中后抑郁(Post-stroke depression,PSD)。腦卒中后抑郁不僅阻礙軀體殘疾的康復(fù),增加腦卒中患者的死亡率、復(fù)發(fā)率,其本身亦嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量,是腦卒中致殘的重要因?yàn)橹?。腦卒中患者中抑郁的發(fā)病率明

2、顯高于普通人群,在綜合醫(yī)院不同疾病患者伴發(fā)抑郁障礙比例中腦卒中患者伴發(fā)抑郁比例較高,國(guó)內(nèi)報(bào)道發(fā)病率為31.2％～63.1％,國(guó)外報(bào)道為25％～79％,從大量的臨床報(bào)道可見(jiàn)PSD的發(fā)生率集中在40％～50％。隨著生物醫(yī)學(xué)模式向生物-心理-社會(huì)醫(yī)學(xué)模式的轉(zhuǎn)換,卒中后抑郁及卒中后抗抑郁藥物治療備受重視。
　　 卒中后抑郁癥的發(fā)病機(jī)制尚不明確,涉及生物學(xué)機(jī)制(與心境調(diào)節(jié)有關(guān)的神經(jīng)化學(xué)、神經(jīng)傳導(dǎo)通路,疾病遺傳易感性)及社會(huì)心理應(yīng)激等多方面

3、。長(zhǎng)久以來(lái),學(xué)者們圍繞著單胺能假說(shuō)研究,與單胺神經(jīng)能遞質(zhì)5-羥色胺(5-HT)、去甲腎上腺素(NE)和多巴胺(DA)等代謝、轉(zhuǎn)運(yùn)、調(diào)節(jié)有關(guān)的基因一直是研究熱點(diǎn),但多發(fā)現(xiàn)上述神經(jīng)遞質(zhì)的降低或增高與抑郁發(fā)病無(wú)明確聯(lián)系,基因方面研究也沒(méi)有得到一致的結(jié)果。因此有人推測(cè)抑郁癥發(fā)生的關(guān)鍵可能不局限于受體或受體前,于是最近陸續(xù)出現(xiàn)了抑郁癥與G蛋白β3基因、cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(CREB)基因、腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)基因與抑郁發(fā)生的關(guān)聯(lián)研究

4、。這些基因主要與神經(jīng)元軸突生長(zhǎng)分化、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)、突觸可塑性等受體后信號(hào)傳導(dǎo)通路相關(guān),提示卒中后抑郁可能存在信號(hào)通路、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)等方面的異常改變。
　　 Walton等研究中度腦缺氧缺血(hypoxic-ischemia,HI)后,凋亡耐受神經(jīng)元(齒狀回顆粒細(xì)胞)的CREB磷酸化作用呈遲發(fā)增高,而在死亡過(guò)程中的CA1錐神經(jīng)元CREB(磷酸化的和非磷酸化的)則急劇喪失,從而推斷在細(xì)胞死亡開(kāi)始之前,支持活化的CREB對(duì)海馬神經(jīng)元的細(xì)胞生存

5、有著重要的作用。在他們的另一個(gè)全腦缺血模型中該推斷也得到了證實(shí)。Tanka等研究局灶性腦缺血后,梗死周?chē)鷧^(qū)磷酸化的CREB(pCREB)水平顯著高,而梗死中心區(qū)CREB免疫反應(yīng)細(xì)胞數(shù)則顯著減少。
　　 缺血性腦損傷后存在細(xì)胞死亡和細(xì)胞存活兩種平行機(jī)制,在神經(jīng)元缺血后存活機(jī)制中,CREB可能起關(guān)鍵作用,而抗抑郁藥作用機(jī)制是通過(guò)激活多條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,最終引起核轉(zhuǎn)錄因子CREB磷酸化,進(jìn)而調(diào)節(jié)許多促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、存活和神經(jīng)可塑性的

6、基因表達(dá),如BDNF、神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、胰島素樣生長(zhǎng)因子Ⅰ(IGF2Ⅰ)、激活素(activin)等,發(fā)揮抗抑郁效應(yīng)。因此學(xué)者認(rèn)為CREB在卒中后抑郁的關(guān)鍵性因子之一。
　　 CREB作為神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的交匯點(diǎn),是多種蛋白激酶的磷酸化底物,其中最早被確認(rèn)的為蛋白激酶A(PKA)。當(dāng)胞漿中的cAMP濃度升高時(shí),PKA能特異性識(shí)別CREB的Ser133磷酸化位點(diǎn),促使CREB結(jié)合蛋白(CB

7、P)與CREB結(jié)合,從而使轉(zhuǎn)錄過(guò)程增強(qiáng)。其他能使CREB磷酸化的蛋白激酶還有Ca2+依賴的蛋白激酶C(PKC)、酪氨酸激酶CK11和鈣-鈣調(diào)蛋白激酶CaMK、MAP激酶等。CREB作為一個(gè)重要的整合器,將影響神經(jīng)可塑性和神經(jīng)元存活的細(xì)胞外刺激進(jìn)行整合,來(lái)影響下游靶基因(包括BDNF基因)的表達(dá)。
　　 CREB是作為記憶功能蛋白在1986年被Montminy、Short及Comb發(fā)現(xiàn)并命名的。他們分別在腦啡膚原、烯醇丙酮酸磷酸梭

8、激酶基因5’端轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)內(nèi)發(fā)現(xiàn)的一段長(zhǎng)約3ObP的cAMP應(yīng)答序列,為細(xì)胞核內(nèi)的一種調(diào)控因子,是轉(zhuǎn)錄因子中亮氨酸鋅指家族的主要成員之一,為許多基因的轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)所必需,因而又被稱(chēng)為轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)因子。CREB在大腦皮層與海馬組織均有廣泛表達(dá),其中CREB在大腦的分布:CREB在分子層內(nèi)的神經(jīng)元、顆粒層的星形細(xì)胞及錐體細(xì)胞層細(xì)胞核內(nèi)均有棕黃色顆粒的陽(yáng)性表達(dá),尤其在外顆粒層的細(xì)胞核內(nèi)表達(dá)最深；CREB在海馬組織的分布:以海馬齒狀回的顆粒細(xì)胞層著色最深

9、,呈棕黃色,CA3區(qū)次之,CA1去著色最淡。
　　 多項(xiàng)臨床前期和臨床研究均表明CREB在抑郁癥的病理生理機(jī)制和抗抑郁治療的作用機(jī)制中可能具有重要作用,抗抑郁藥可以引起CREB表達(dá)增加。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中慢性給予氟西汀,可以提高大鼠杏仁核、皮層、海馬等多個(gè)腦區(qū)磷酸化CREB水平,而去甲丙米嗪只提高海馬齒狀回磷酸化CREB水平。用BrdU標(biāo)記新生海馬神經(jīng)元,該神經(jīng)元在形成后1～2周開(kāi)始表達(dá)磷酸化CREB,在4周時(shí)磷酸化CREB表達(dá)降低,提

10、示磷酸化CREB可能主要在海馬神經(jīng)元早期存活中起作用；Hastings等2002年研究提示CREB可能是通過(guò)阻止凋亡,以確保存活到成熟神經(jīng)元。Lai等臨床研究顯示,用RT2PCR的方法檢測(cè)重癥抑郁癥患者外周白細(xì)胞CREBmRNA在抗抑郁治療前后的表達(dá),并與正常人作對(duì)照,結(jié)果顯示CREB mRNA表達(dá)在正常人和患者之間沒(méi)有明顯差異,但是在經(jīng)8周抗抑郁治療后的患者中表達(dá)明顯下降,這種改變與抗抑郁藥類(lèi)型和療效無(wú)關(guān)。此項(xiàng)臨床研究從另一方面提示,

11、CREB在外周表達(dá)的規(guī)律與中樞可能不同,提示評(píng)價(jià)CREB在慢性抗抑郁治療中的作用尚有待深入。抑郁癥可能存在CREB及p-CREB介導(dǎo)的調(diào)控過(guò)程異常,而CREB可能是抗抑郁藥及ECT治療的共同受體后靶點(diǎn),這也可以部分解釋抗抑郁藥起效延遲的因?yàn)?。此?有研究者已經(jīng)提出cREB水平的變化可作為抑郁癥患者患病及其抗抑郁治療療效預(yù)測(cè)的狀態(tài)性標(biāo)志。己知編碼人類(lèi)CREB1基因定位于染色體2q32-q34,zubenko等曾經(jīng)報(bào)道他們?cè)谌旧w2q33-

12、34上包含CREB1基因在內(nèi)的451kb區(qū)域內(nèi)找到了與抑郁癥連鎖的證據(jù),且這種連鎖關(guān)系僅見(jiàn)于女性。因此,從基因的染色體定位及其功能上均提示我們cREB1基因可能是卒中后抑郁的候選基因。
　　 目的
　　 本實(shí)驗(yàn)?zāi)康脑谟谔接慍REB1基因兩個(gè)SNP位點(diǎn)rs10932201和rs6740584多態(tài)性與卒中后抑郁遺傳易感性的關(guān)系,為下一步的基因診斷、基因治療、抗抑郁藥物研究提供理論依據(jù)。
　　 方法
　　 以珠

13、江醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科住院病人作為研究對(duì)象,病例組根據(jù)第四次全國(guó)腦血管學(xué)術(shù)會(huì)議做出中風(fēng)診斷和漢密爾頓抑郁量表做出抑郁診斷,按入組條件及排除標(biāo)準(zhǔn)入組病例(腦卒中后抑郁組)組50例,分為對(duì)照50例。被試者抽全血2mL,EDTA抗凝后采用苯酚-氯仿抽提法提取外周血白細(xì)胞基因組DNA。利用聚合酶鏈反應(yīng)一限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性技術(shù),應(yīng)用上游5’-TAC CTC CCC AGCCCT TAG-3’,下游為:5’-GGA AGC AGT CCA ATA GAA

14、 CA-3’引物擴(kuò)增CREB1基因SNP rs10932201,用Hinf Ⅰ內(nèi)切酶檢測(cè)rs10932201 G→A多態(tài)性；應(yīng)用上游5’-GAG GTT GAG TCT GGA GGA T 3’,下游5’-TAT TGG AAA GGT GGAGGA C-3’引物擴(kuò)增 CREB1基因SNP rs6740584,用Ssp Ⅰ內(nèi)切酶檢測(cè)rs6740584C→T多態(tài)性。比較基因頻率和基因型運(yùn)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件包,采用卡方檢驗(yàn)計(jì)算單純卒

15、中患者與卒中后抑郁患者之間各等位基因頻率或突變頻率分布。
　　 結(jié)論
　　 CREB1 rs10932201SNP位點(diǎn)與PSD遺傳易感性無(wú)關(guān)聯(lián)；CREB1 rs6740584SNP位點(diǎn)與PSD遺傳易感性有明確的相關(guān)性,提示攜帶突變基因T可以增加PSD的發(fā)病率,其功能的變化可能影響CERB的表達(dá)從而影響神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),這種關(guān)系主要見(jiàn)于女性患者。表明CREB1基因rs6740584可能在女性中風(fēng)后抑郁癥的遺傳學(xué)發(fā)病機(jī)