1、失血性休克可導致機體各組織器官損傷，其中腸道是最容易受損傷的主要靶器官。失血性休克后腸粘膜上皮細胞缺血缺氧，能量代謝障礙是不可逆性休克和多器官功能衰竭的重要原因。線粒體是能量轉換的細胞器，在維持細胞正常的能量代謝、結構和功能方面具有重要作用。線粒體氧化磷酸化過程由mtDNA(mitochondrialDNA，mtDNA)和nDNA(nuclearDNA，nDNA)共同編碼的5個酶復合體組成的呼吸鏈完成。mtDNA編碼13條多肽,mtDN

2、A功能是相對獨立的，但nDNA在其復制、表達及線粒體蛋白質組裝等方面均起著重要的作用。nDNA和mtDNA在轉錄水平也是協(xié)同表達的，其協(xié)同表達需要一定的轉錄和復制因子，這些核調控因子在控制核一線粒體相互作用中發(fā)揮重要作用，也對mtDNA復制表達起著調控作用。 基因表達調控是在多級水平上進行的復雜事件。線粒體基因組與核基因組在遺傳信息表達上關系密切，基因的缺失和突變可能導致核質基因不協(xié)調，使能量代謝效率降低。在嚴重創(chuàng)傷、失血性休克

3、等病理條件下，調控線粒體基因表達的細胞轉錄因子過氧化物酶體增殖物激活受體Y輔激活因子1(peroxisomeprolifemtor-activatedreceptorYcoactivator-1，PGC-1)、線粒體轉錄因子(mitochondrialtranscriptionfactorA,mtTFA)和核呼吸因子(nuclearrespiratorytranscriptionfactors,NRFs)等基因的表達變化規(guī)律，國內外文獻

4、尚缺乏相關報道。mtDNA編碼基因mRNA的改變是線粒體受損傷后功能下降引起的還是核編碼調控因子表達的改變引起的，在休克缺血缺氧時核編碼調控因子表達的改變對mtDNA編碼基因mRNA表達有無影響或影響程度如何，都需要加以闡明。 已知三七皂甙單體Rg1可通過對線粒體的形態(tài)功能、COX活性和基因表達多方面的調節(jié)作用，而保護線粒體。但Rg1是如何上調COX基因表達，在細胞核對線粒體基因調控的過程中發(fā)揮了什么作用還未闡明。研究失血性休克

5、時Rg1對PGC-1，mtTFA,NRF-1，等基因表達的影響，探討Rg1對PGC-1、mtTFA和NRF-1等基因表達的作用，從而可在基因調控水平探討Rg1對失血性休克動物的保護機理，為Rg1治療失血性休克提供充分的理論的依據。 目的： 1.研究失血性休克大鼠腸上皮細胞mtDNACOXI基因的損傷，及對其編碼蛋白質三維結構的影響，闡明失血性休克與細胞COXI基因損傷的關系。 2.研究失血性休克大鼠缺血缺氧腸上皮

6、細胞調控線粒體基因表達的核轉錄因子PGC-1、mtTFA、NRF-1等基因表達的改變，研究核編碼線粒體蛋白COXIV、線粒體編碼線粒體蛋白COXI基因表達的改變。探討失血性休克時這些核轉錄因子對COXⅣ和COXI基因表達及線粒體功能的影響，揭示核基因和線粒體基因在失血性休克細胞線粒體能量代謝障礙中的作用。 3.研究Rg1對失血性休克大鼠腸上皮細胞PGC-1、mtTFA、NRF-1及COxIV、COXⅠ等基因表達的影響，探討Rg1

7、在PGC-1、mtTFA、NRF-1等基因表達過程中的作用，從而在基因調控水平探討Rg1對核及線粒體基因表達及失血生休克動物的保護效應，探索其保護機理。 方法： Wistar大鼠120只，按改良Wigger’s法制作失血性休克模型，動物隨機分為對照組、失血性休克組、治療組，其中治療組又分為單純復蘇對照組，復蘇加Rg1治療組，復蘇加SB202190組，復蘇加茴香霉素組，復蘇加Rg1加SB202190組，復蘇加Rg1加茴香霉

8、素組。于失血性休克后不同時相分離腸上皮細胞及其線粒體，提取mtDNA、細胞總蛋白、總RNA及制備電鏡標本，采用PCR產物直接測序法檢測腸上皮細胞mtDNACOXI基因損傷，并利用計算機同源模建的方法進行腸上皮細胞mtDNACOXI基因突變位點與其編碼蛋白質結構的改變及其對功能的影響；采用RT-PCR法檢測腸上皮細胞核基因PGC-1、mtTFA、NRF-1、COXⅣ及mtDNACOXImRNA的莉達變化；采用Westem-blot法檢測腸

9、上皮細胞PGC-1蛋白的表達變化；采用紫外分光光度法檢測COX活性；采用熒光分光光度法檢測線粒體膜電位。從失血性休克大鼠核轉錄因子及其輔激活因子的表達、編碼線粒體蛋白基因表達、線粒體COX活性、線粒體膜電位等多方面研究失血生休克時線粒體基因和核基因損傷及其核轉錄因子在其中起的作用，并探討三七皂甙單體Rg1對缺血缺氧性細胞及其線粒體損傷的保護作用。 結果： 1.失血性休克5h可導致大鼠腸上皮細胞mtDNACOXI基因從55

10、45到6838位點出現(xiàn)了31個散在性點突變，其中大部分導致了編碼氨基酸的改變從而使突變區(qū)的30-32肽段結構發(fā)生了明顯變化。 2。失血性休克1h大鼠腸上皮細胞PGC-1mRNA表達增加，失血性休克3h后又開始減弱，休克晚期PGC-1mRNA表達顯著減弱；失血性休克2hPGC-1蛋白表達增強，后又減弱，失血f生休克5h已明顯弱于休克前。復蘇加Rg1可上調輔激活因子PGC-1mRNA及其蛋白表達。Rg1在SB202190存在時，不能

11、上調PGC-1mRNA及其蛋白表達，但Rg1和茴香霉素同時作用時PGC-1mRNA及其蛋白明顯增強。 3.失血性休克早期NRF1和mtTFAmRNA表達變化不明顯，至休克3，4h分別有所增強，到休克5h均下降到休克前水平。Rg1不能上調NRF-1和mtTFAmRNA表達，但Rg1與茴香霉素一起作用時上調mtTFA和NRF-1mRNA表達。 4.失血性休克1h大鼠腸上皮細胞COXImRNA表達開始增加，3h達高峰，后又降低

12、，到休克5h顯著低于休克前水平。失血性休克大鼠腸上皮細胞核基因編碼COXⅣmRNA休克3h略有增高，休克4h后開始下降，至休克晚期低于休克前水平。復蘇加Rg1能增強COXI、COXⅣmRNA表達，復蘇加Rg1與SB202190或茴香霉素一起作用時均能上調COXI、COXⅣmRNA表達。 結論及討論： 1.失血性休克晚期可導致大鼠腸上皮細胞mtDNACOXI基因突變；COXI基因突變后，因使其編碼氨基酸發(fā)生改變而使突變區(qū)3

13、0-32肽段結構發(fā)生明顯變化，從而改變了附近的電荷性質、親疏水性質和空間特性，直接影響了全酶復合物的形成，減弱了COX的活性。 2.失血性休克大鼠腸上皮細胞PGC-1mRNA表達先增強后減弱，NRF1和mtTFAmRNA表達變化不明顯，說明PGC-1對缺血缺氧比較敏感，休克晚期PGC-1表達顯著降低，對線粒體和細胞核基因組均有一定影響；而且失血性休克時PGC-1和NRF-1及mtTFA的轉錄水平變化趨勢并不一致，NRF-1及mt

14、TFAmRNA表達變化有一個相對滯后的過程。NRF-1及mtTFAmRNA表達變化在休克時發(fā)生較晚，且升高幅度較小，說明休克時核基因調控能力下降，也是線粒體基因表達下降的重要原因。 3.失血性休克早期PGC-1蛋白表達增強，晚期減弱，說明缺血缺氧早期可上調PGC-1蛋白表達，可能與PGC-1mRNA的上調有關。 4.失血性休克中期大鼠腸上皮細胞核基因編碼COXIVmRNA略有增高，至休克晚期低于休克前水平，相對于線粒體編

15、碼基因COXImRNA來說，上調慢、維持時間短，說明失血性休克早期COXIV基因對缺血缺氧沒有COXI敏感。 5.復蘇加Rg1可上調PGC-1mRNA表達，復蘇加Rg1在SB202190或茴香霉素存在時，前者不能上調PGC-1mRNA及其蛋白表達，但后者使PGC-1mRNA及其蛋白表達量明顯增加，提示PGC-1mRNA上調可以促進PGC-1蛋白表達，PG-C-1蛋白合成在轉錄水平的調節(jié)非常重要。復蘇加Rg1不能上調NRF-1和m

16、tTFAmRNA表達，但Rg1與茴香霉素一起作用時均上調mtTFA和NRF-1mRNA表達，說明Rg1能減輕休克缺血缺氧所致細胞損傷，能有效維持細胞間通訊和細胞內信息傳遞，為細胞的一些特異程序的完成提供了必要的條件。 6.復蘇加Rg1能增強COXI、COXⅣmRNA表達，復蘇加Rg1加SB202190或茴香霉素一起作用時均能上調COXI、COXⅣmRNA表達，表明三七皂甙單體Rg1可能是直接從轉錄水平上調線粒體編碼基因COXI、

17、核編碼COXⅣ基因mRNA，并有利于蛋白質合成，改善線粒體功能，從而可減輕線粒體功能障礙所致缺血缺氧性細胞損傷。 7.復蘇加Rg1可顯著提高COX活性，可使其活性維持在較高水平，且在SB202190或茴香霉素存在時，仍然能提高COX活性，但復蘇加SB202190或茴香霉素均幾乎不提高該酶活性。說明三七皂甙單體Rg1可顯著提高COX活性。Rg1提高COX活性可能和提高該酶的產量和質量有關。 8.復蘇加Rg1治療后，線粒體膜