1、糖尿病腎病是糖尿病患者最主要的微血管病變，發(fā)病率高，美國疾病控制中心資料顯示，DN患者約占DM總人數(shù)的67％以上。據(jù)美國、日本及許多西歐國家統(tǒng)計資料表明，DN已經(jīng)上升為終末期腎臟病的首位病因，在美國、日本的透析患者中，DN患者所占比例接近50％。隨著生活水平的提高和生活方式的變化，我國DM和DN發(fā)病率也成上升趨勢。目前臨床上早期診斷DN的主要依據(jù)是微量蛋白尿，而DM患者一旦出現(xiàn)微量蛋白尿，約有30～45％的DN患者將不可避免地進展到明顯

2、蛋白尿進而發(fā)展至慢性腎功能衰退及ESRD。由于DN患者機體存在極其復雜的代謝紊亂，一旦發(fā)展至終末階段，往往比其他腎臟疾病治療更加棘手。而目前臨床尚缺乏針對DN有效的特異性治療。由于DM患者，尤其是2型DM患者常伴有代謝綜合征的其他表現(xiàn)，如高血壓、高脂血癥、中心性肥胖等，因此臨床上針對DN的治療以綜合治療為主，包括控制血糖、控制血壓、降脂治療及終末期替代治療等，而治療費用昂貴、療效差和患者病死率高，一直是糖尿病領域和腎臟病領域學者面臨的問

3、題。進一步探索DN的發(fā)病機制，以便制定更加有效的防治措施無疑是當今醫(yī)學界急待解決的重大課題。
　　 DN發(fā)病機制十分復雜，包括了眾多因素參與。總的來說，它是起始于糖代謝障礙所致的血糖過高，在一定遺傳背景以及一些相關的獲得性危險因子參與下，通過啟動許多細胞因子網(wǎng)絡，終于造成腎臟的損害。雖然有關DN的研究取得了很大的進展，但其發(fā)病機制尚未完全清楚。近年來，蛋白質組學技術在腎臟領域的研究逐漸增多，這對于深入了解腎臟的生理功能、揭示腎臟

4、病的發(fā)病機理、發(fā)現(xiàn)新的診斷標志物以及識別新的治療靶點有著深遠的意義。而蛋白質組學技術也為深入研究DN發(fā)病機制提供了全新的方法。
　　 本論文我們利用蛋白質組學技術對鏈脲佐菌素誘導的糖尿病大鼠腎組織蛋白質差異表達進行了研究，并進一步對其中的差異表達蛋白——谷胱甘肽轉硫酶Mu亞型在DN進展中的作用及干預治療的意義進行了探討。
　　 第一部分 GSTM在STZ誘導的DM大鼠腎臟表達的研究
　　 研究背景和目的：

5、　　 隨著人類基因組計劃工作的完成，生物醫(yī)學領域已經(jīng)開始在基因水平對各種疾病進行深入的研究，但人們也逐漸認識到基因只是遺傳信息的載體，而生理活動的執(zhí)行者是基因的表達產(chǎn)物——蛋白質，要研究生命現(xiàn)象、闡明生命活動規(guī)律，需要對蛋白質進行全面的研究。只有對蛋白質數(shù)量、結構、性質、相互關系和生物功能全面認識，才能揭開生命現(xiàn)象的本質。因此，蛋白質組學已成為“后基因組時期”生物醫(yī)學研究的重點內(nèi)容之一。
　　 近年來，蛋白質組學技術在腎臟領域

6、的研究也逐漸增多，這對于深入了解腎臟的生理功能、揭示腎臟病的發(fā)病機理、發(fā)現(xiàn)新的診斷標志物以及識別新的治療靶點有著深遠的意義。而蛋白質組學技術也為深入研究DN發(fā)病機制提供了全新的方法。
　　 論文第一部分我們利用蛋白質組學技術對STZ誘導的糖尿病大鼠腎組織蛋白質差異表達進行了研究，以尋求糖尿病腎病可能的發(fā)病機制和治療的新靶點。
　　 材料和方法
　　 健康雄性Wistar大鼠40只，隨機選取12只作為正常對照組，其

7、余28只用來建立糖尿病大鼠模型，作為糖尿病組。正常對照組一次性尾靜脈注射0.1％檸檬酸緩沖液，DM組一次性尾靜脈注射0.1％STZ檸檬酸緩沖液55mg/kg，5天后取鼠尾血測定血糖，篩選模型成功的大鼠。以STZ注射5天后空腹血糖水平≥16.7mmol/L為糖尿病模型成功的標準。所有大鼠標準飼料喂養(yǎng)，自由飲水，持續(xù)觀察24周。于第24周末處死大鼠，取血測定空腹血糖、尿素氮、肌酐、白蛋白、尿酸、總膽固醇、甘油三酯、糖基化血紅蛋白和晚期糖基化

8、終末產(chǎn)物；留尿測定24小時尿蛋白；取腎組織PAS染色觀察腎臟病理改變，應用雙向凝膠電泳和質譜鑒定方法比較DM大鼠腎組織蛋白質的差異表達。
　　 結果：
　　 1.第24周時DM組大鼠FPG、HbA1c、AGEs水平與C組相比較均顯著升高；24h尿蛋白定量較C組大鼠增多。
　　 2.光鏡下PAS染色顯示，與C組比較，DM組大鼠腎小球ECM增多，系膜細胞增生，同時毛細血管部分塌陷，腎小囊部分粘連。
　　 3.

9、雙相電泳及質譜分析發(fā)現(xiàn)的DM大鼠腎組織的差異表達蛋白25個，其中上調(diào)點13個，下調(diào)點12個，其生物功能包括物質代謝、氧化應激、信號傳導、細胞增殖、細胞生長、細胞凋亡和熱休克等。
　　 4.25個差異表達的蛋白中GSTM在DM組表達較C組上調(diào)。Westen Blot檢測發(fā)現(xiàn)DM組大鼠腎組織GSTM的表達也較C組顯著增高，與蛋白質組學結果一致。
　　 結論：
　　 1.蛋白質組學技術是研究DN的發(fā)病機制和治療的新靶點

10、的有效方法；我們利用雙相電泳及質譜分析發(fā)現(xiàn)的DM大鼠腎組織的差異表達蛋白25個，其中上調(diào)點13個，下調(diào)點12個，其生物功能包括物質代謝、氧化應激、信號傳導、細胞增殖、細胞生長、細胞凋亡和熱休克等，這些差異表達的蛋白可能參與DN的發(fā)病。
　　 2.對兩組大鼠腎組織GSTM的表達進行檢測，發(fā)現(xiàn)DM組大鼠腎組織GSTM的表達較C組增高，提示GSTM可能在DN的發(fā)病中起一定的作用，我們將在今后工作中做進一步深入的研究。
　　 第

11、二部分高糖誘導大鼠系膜細胞GSTM的表達及干預治療的實驗研究
　　 研究背景和目的：
　　 系膜細胞是腎臟固有細胞之一，具有多種生理功能，在病理情況下，MC與其他腎臟組織細胞一樣，不但是疾病的受害者，而且也是直接的參與者。它能通過自身細胞的增殖及轉分化，通過產(chǎn)生各種致炎、致纖維化物質而影響疾病的進程。事實上，MC增生及系膜硬化是最為常見的對各種腎小球損傷的反應。利用體外培養(yǎng)的MC進行細胞生物學研究，對深入了解腎臟的生理及

12、病理生理的變化，了解各種腎臟疾病的發(fā)病機制具有十分重要的作用。
　　 DN在組織學上的特征性改變包括腎小球基底膜增厚和系膜基質合成增多，而系膜基質合成增多主要是由MC產(chǎn)生增多。久而久之，腎臟出現(xiàn)腎小球硬化，相應的腎小管萎縮、腎間質纖維化，可見MC在DN的發(fā)生和發(fā)展中起重要作用。
　　 由于以上原因，我們選擇了體外培養(yǎng)的大鼠系膜細胞，研究高糖刺激下GSTM在RMC的表達情況及抗氧化劑白藜蘆醇干預治療的意義，以期了解GSTM

13、在DN發(fā)病中的作用。
　　 材料和方法：
　　 常規(guī)體外培養(yǎng)大鼠系膜細胞，分為5組：①正常對照組(C組)；②高糖組(HG組)；③高糖+2.5μM白藜蘆醇組(T1組)；④高糖+5μM白藜蘆醇組(T2組)；⑤高糖+10μM白藜蘆醇組(T3組)。治療組相應濃度白藜蘆醇預孵育1h，在高糖條件下培養(yǎng)48h，應用MTT比色法和CCK8法測定系膜細胞增殖。收集細胞用流式細胞儀Annexin V/PI雙染色法檢測細胞凋亡，PI染色法檢測

14、細胞周期； Westen Blot檢測系膜細胞GSTM和Nrf2的表達。
　　 結果：
　　 1.MTT比色法測定HG組較C組RMC增殖率增高，Res治療后T2、T3組增殖率較HG組減低，T1組增殖率較HG組減低，但無統(tǒng)計學意義。CCK8法測定HG組增殖率較C組增高，Res治療后T1、T2、T3組均較HG組增殖率減低，且三個治療組間增殖率有差異，隨Res濃度增加增殖率降低。
　　 2.HG組G1期細胞比例較C組增

15、高(P＜0.05)，Res治療后T3組G1期細胞比例較HG組減少(P＜0.05)，而T1、T2組G1期細胞比例雖較HG組減少，但無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。HG組S期細胞比例較C組減少(P＜0.01)，Res治療后T2、T3組S期細胞比例較HG組增高(P＜0.01)。三個治療組間T2、T3兩組S期細胞比例較T1組增高(P＜0.05)，T2與T3組之間無差別(P＞0.05)。各組間G2期細胞比例無差異(P＞0.05)。
　　 3

16、.HG組細胞凋亡率與C組無差別(P＞0.05)，Res治療后T2、T3組凋亡率較HG組增加(P＜0.01)，T1組凋亡率雖較HG組增高，但無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。
　　 4.HG組GSTM表達較C組增高(P＜0.001)，Res治療后T2、T3組GSTM表達較HG組減低(P＜0.01)，T1組GSTM表達較HG組減低，但無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。三個治療組之間GSTM表達均有差異(P＜0.05)，隨Res濃度增加GST

17、M表達減少。
　　 5.HG組Nrf2表達較C組增高(P＜0.001)，Res治療后T2、T3組Nrf2表達較HG組減低(P＜0.01，P＜0.001)，T1組Nrf2表達較HG組減低，但無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。三個治療組之間Nrf2表達有差異(P＜0.05)，隨Res濃度增加Nrf2表達減少。
　　 結論：
　　 1.在高糖刺激下，系膜細胞GSTM表達上調(diào)，這可能是DM大鼠腎組織GSTM表達上調(diào)的原因之一

18、。
　　 2.Res干預治療高糖刺激下的RMC，下調(diào)GSTM表達對RMC起保護作用。Res下調(diào)系膜細胞GSTM表達是通過調(diào)節(jié)上游基因Nrf2的表達實現(xiàn)的。
　　 3.Res能抑制高糖誘導的RMC增殖，且抑制作用存在一定的量效依賴關系。
　　 (1)Res抑制RMC的增殖與影響RMC的細胞周期有關。Res能抑制RMC從S期進入G2/M期，將RMC阻滯于S期，對高糖誘導的RMC增殖起抑制作用。
　　 (2)誘