1、目的：糖尿病腎病（DN）是糖尿病最常見、最嚴重的慢性微血管并發(fā)癥。隨著全球范圍內糖尿?。―M）發(fā)病率逐年升高，糖尿病腎病逐漸成為導致終末期腎衰竭（ESRF）的首位或主要病因，患者最終只能依靠透析或腎移植維持生命，嚴重影響了生存質量，給家庭和社會帶來沉重的經濟負擔和精神壓力。如何早期有效防治糖尿病腎病是當今國內外學者熱切關注的課題。
　　 糖尿病腎病的病理特征是腎小球系膜細胞增生、肥大，細胞外基質積聚，最終發(fā)生腎小球硬化。腎小球系

2、膜細胞（GMC）是腎臟重要的固有細胞（inherent cell）之一，在腎臟的組織結構和生理功能方面發(fā)揮著重要作用，具有產生細胞外基質、分泌細胞因子、吞噬和清除異物等多種功能。腎小球系膜細胞也是多種致病因子作用的主要靶細胞，在病變進展中扮演著重要角色。Megsin是一種系膜細胞優(yōu)勢表達基因，定位于18q21.3，編碼蛋白N末端可變反應活性環(huán)（RSL）與絲氨酸蛋白酶結合，發(fā)揮絲氨酸蛋白酶抑制劑（serpin）活性。Serpin家族成員眾

3、多，功能涉及凝血、纖溶、炎癥、細胞增殖、凋亡、信號轉導、消化等多個系統(tǒng)，serpin與其作用底物絲氨酸蛋白酶之間的動態(tài)平衡與機體各項生理活動的正常進行息息相關，推測megsin作為serpin的成員之一，勢必參與系膜細胞的某些生理活動，探討megsin在腎小球系膜細胞中的作用對于深入揭示糖尿病腎病的發(fā)生機制具有重要意義。
　　 本研究擬通過臨床和基礎研究兩方面，觀察megsin在糖尿病狀態(tài)下腎組織中的表達變化；分別構建megsi

4、n表達質粒和megsin siRNA表達質粒，轉染CD-1小鼠和小鼠腎臟系膜細胞，從整體、細胞和分子水平探討megsin與系膜細胞增殖程度、細胞外基質代謝關鍵酶基質金屬蛋白酶-2（MMP-2）/組織型抑制劑-2（TIMP-2）以及細胞周期抑制蛋白P27水平之間的關系，探討megsin在糖尿病腎病早期的致病機制；通過Sprague-dawlay（SD）大鼠糖尿病模型干預實驗，觀察羥甲基戊二酰輔酶A（HMG-CoA）還原酶抑制劑（HCRI）

5、對腎組織megsin表達的影響，最終來闡明megsin參與早期糖尿病腎病發(fā)生的作用，篩選從基因或蛋白水平阻斷megsin致病作用的有效途徑，為進一步闡明糖尿病腎病發(fā)病的分子機制及其防治提供一條新思路。
　　 方法：
　　 第一部分：從該院腎內科2006年6月至2007年6月住院患者中選擇符合1999年WHO糖尿病診斷標準的2型糖尿病患者60例和原發(fā)性腎病綜合征患者38例，經腎活檢病理檢查并結合臨床資料確診糖尿病腎病18例

6、和微小病變性腎小球病，確定為研究對象，另外5例正常腎組織（選自該院泌尿外科腎癌患者手術切除的腎臟病灶遠周部分）作為正常對照組，進行免疫組織化學染色，并半定量分析各組腎組織標本中megsin的表達。
　　 第二部分：建立單側腎切除+鏈脲佐菌素誘導的CD-1小鼠糖尿病模型，構建megsin表達質粒并經尾靜脈注射轉染小鼠（C組，n=15），每周1次，同時設立單純單側腎切除組（A組，n=15）和單側腎切除+糖尿病+空質粒轉染組（B組，n

7、=15），實驗共12周，分別于第1、2和12周末收集各組小鼠血、尿和腎組織標本，測定血糖（BG）、血肌酐（Scr）、腎重/體重比值（KW/BW）、尿蛋白（UP），分別應用免疫組織化學染色和western blot測定腎組織中megsin、MMP-2、TIMP-2、P27和Ⅳ型膠原的表達；建立穩(wěn)定表達megsin的小鼠系膜細胞株（D組），高糖環(huán)境中培養(yǎng)48小時，同時設立野生型小鼠系膜細胞正常糖培養(yǎng)組（A組）、高糖培養(yǎng)組（B組）和megsi

8、n質粒對照+高糖培養(yǎng)組（C組），分別于12、24和48小時末收集各組細胞及上清，提取蛋白，應用western blot測定各組總蛋白中megsin、MMP-2、TIMP-2和P27的表達，放免法測定細胞上清液中Ⅳ型膠原濃度（結果用總蛋白校正）。
　　 第三部分：動物模型制備同第二部分，構建megsin siRNA表達質粒并經尾靜脈注射轉染糖尿病小鼠（C組，n=15），每周1次，同時設立單純單側腎切除組（A組，n=15）和單側腎切

9、除+糖尿病+空質粒轉染組（B組，n=15），實驗共12周，分別于第1、2和12周末收集各組小鼠血、尿和腎組織標本，測定血糖（BG）、血肌酐（Scr）、腎重/體重比值（KW/BW）、尿蛋白（UP），分別應用免疫組織化學染色和western blot測定腎組織中megsin、MMP-2、TIMP-2、P27和Ⅳ型膠原的表達；體外培養(yǎng)小鼠系膜細胞，應用脂質體2000瞬時轉染megsin siRNA質粒，高糖環(huán)境中培養(yǎng)48小時，同時設立小鼠系膜

10、細胞正常糖培養(yǎng)組、高糖培養(yǎng)組和空質粒+高糖培養(yǎng)組，分別于12、24和48小時末收集各組細胞及上清，提取蛋白，應用western blot測定各組總蛋白中megsin、MMP-2、TIMP-2和P27的表達，放免法測定細胞上清液中Ⅳ型膠原濃度（結果用總蛋白校正）。
　　 第四部分：建立鏈脲佐菌素誘導的SD大鼠糖尿病模型，給予氟伐他汀干預（2mg·kg-1·d-1灌胃，DF組，n=6），同時設立糖尿病對照組（DC組，n=6）和正常對

11、照組（NC組，n=6），于實驗第6周末用代謝籠收集各組大鼠血、尿及腎組織標本，測定BG、血清總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、血肌酐（Scr）和尿肌酐（Ucr），并計算肌酐清除率（Ccr），結果用體重校正，放免法測定24h尿白蛋白排泄率（UAER），免疫組織化學染色半定量分析各組大鼠腎組織megsin、Ⅳ型膠原和層黏連蛋白（LN）的表達，并行腎組織過碘酸-希夫（PAS）染色，普通光鏡下觀察腎小球病理學改變。
　　 結果：

12、>　　 第一部分：正常腎組織和微小病變性腎小球病患者腎組織中megsin在腎小球系膜區(qū)無表達或僅微弱表達，兩組間差異無顯著性，而在糖尿病腎病患者腎組織腎小球表達增強，與其他兩組比較差異有顯著性。
　　 第二部分：
　　 1.動物實驗糖尿病小鼠成模4～5天后出現(xiàn)多飲、多食、多尿表現(xiàn)；第1周末B組小鼠腎小球固有細胞數目增多，免疫組化和western blot結果顯示腎小球megsin、TIMP-2、P27和Ⅳ型膠原表達增強

13、，MMP-2表達減弱，C組變化更顯著，三組間差異有顯著性意義；第2周末上述各指標變化更為明顯，三組間比較有顯著性差異；第12周末B組小鼠腎小球固有細胞數目減少，與A組無差異，P27表達水平回落，但仍高于A組，與C組無差異，其他指標如megsin、TIMP-2和Ⅳ型膠原進一步增強，但仍弱于C組，MMP-2表達水平進一步降低，但仍高于C組。
　　 2.細胞培養(yǎng)從12h開始，B組較A組小鼠系膜細胞megsin、P27和TIMP-2蛋白

14、水平開始升高，48h達到高峰，48h時MMP-2水平降至最低，C組和B組相比差異無顯著性，但D組變化趨勢更明顯，與B組和C組相比差異有顯著性意義；從12h開始，B組小鼠系膜細胞上清液中Ⅳ型膠原濃度（細胞總蛋白校正）較A組開始升高，48h達到高峰，C組與B組相比差異無顯著性，但D組系膜細胞上清液中Ⅳ型膠原濃度升高最明顯，與其他組相比差異有顯著性意義。
　　 第三部分：
　　 1.動物實驗糖尿病小鼠成模4～5天后出現(xiàn)與第二部

15、分類似的糖尿病癥狀；第1周末B組小鼠與A組相比，腎小球固有細胞數目增多，免疫組化和western blot結果顯示腎小球megsin、TIMP-2、P27和Ⅳ型膠原表達增強，MMP-2表達減弱，C組上述各指標介于A組和B組之間，三組間差異有顯著性意義；第2周末B組小鼠腎小球固有細胞數目、組織中megsin、MMP-2、TIMP-2、P27和Ⅳ型膠原表達變化更明顯，C組上述各指標介于A組和B組之間，三組間比較有顯著性差異；第12周末B組小

16、鼠腎小球固有細胞數目減少，P27表達水平下降。
　　 2.細胞培養(yǎng)從12h開始，B組較A組小鼠系膜細胞megsin、P27和TIMP-2蛋白水平開始升高，48h達到高峰，48h時MMP-2水平降至最低，C組和B組相比差異無顯著性；D組與B組或C組同期相比，megsin、P27和TIMP-2蛋白水平降低，MMP-2升高，差異有顯著性意義。
　　 第四部分：實驗第6周末DF組和DC組大鼠血糖無差異，但均高于NC組； DC組大

17、鼠腎小球嗜PAS陽性物輕度增多，固有細胞數目增多，血清中TC、TG、Ccr、UAER、腎臟/體重比值以及免疫組化結果顯示組織中megsin、Ⅳ型膠原和層黏連蛋白水平高于NC組，DF組上述指標低于DC組，但高于NC組，三組間差異有顯著性意義。
　　 結論：
　　 1.臨床和實驗研究表明，糖尿病狀態(tài)下megsin在腎小球表達增強，與腎小球系膜增殖、細胞外基質積聚相一致，提示megsin在糖尿病腎病發(fā)生機制中起一定作用。

18、>　　 2.體內和體外實驗證實，過表達megsin可上調腎組織或系膜細胞TIMP-2、P27的表達，下調MMP-2的表達，提示megsin促發(fā)糖尿病腎病發(fā)生的機制與MMP-2/TIMPs和P27有關，但具體作用途徑有待進一步研究闡明。
　　 3.megsin siRNA質粒和HMG-CoA還原酶抑制劑可分別從基因水平和蛋白水平下調megsin的表達，進而下調TIMP-2和P27、上調MMP-2在腎組織中的表達來延緩系膜增殖、細