1、糖尿病腎病是糖尿病的主要并發(fā)癥之一，也是西方國家終末期腎病(ESRD)的首位病因。已有的研究表明，轉化生長因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)可刺激腎實質細胞的肥大，并通過增加細胞外基質的合成，減少細胞外基質的降解而導致腎小球系膜區(qū)及腎小管．間質細胞外基質的積聚，最后導致腎小球硬化、腎小管．間質纖維化和腎血管硬化，發(fā)生腎衰竭。應用抗TGF-β抗體或TGF-β反義寡核苷酸治療可顯著減少細胞外基質

2、的積聚，減輕腎臟纖維化。有足夠的證據提示TGF-β在糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮關鍵作用。 目的：探討鏈脲佐菌素(Streptozocin,STZ)誘導的大鼠糖尿病腎病模型腎組織中Smad信號蛋白的活化狀態(tài)。方法：1、動物分組和模型建立：雄性SD大鼠48只，體重200-250g，分別于成模后4、6、8、10、12、14、16周殺檢6只。另設正常對照組6只。雄性SD大鼠禁食16h后腹腔注射STZ(60mg／kg體重)，并于開始注

3、射STZ后72h后取大鼠尾靜脈血測血糖，凡血糖≥16.7mmol／L確定為糖尿病大鼠模型制作成功。對照組腹腔注射等體積的枸櫞酸緩沖液。2、檢測指標：觀察大鼠一般情況，測體重、腎重、血糖、血壓、尿白蛋白排泄率、血肌酐，24小時尿量；留取大鼠腎組織做PAS及Masson染色；用RT-PCR檢測大鼠腎組織TGF-β 1、Smad2、Smad3、α-SMA、E-cadherin mRNA水平;免疫組織化學檢測大鼠腎組織中p-Smad2／3、α-

4、SMA和E-cadherin的表達；Western-blot檢測大鼠腎組織α-SMA和E-cadherin的蛋白表達水平。結果：1、大鼠糖尿病腎病模型的建立。腹腔注射STZ后，糖尿病大鼠出現明顯的多食、多飲、多尿和體重下降等糖尿病癥狀，血糖明顯升高，腎小球體積增大，腎重／體重比值增加，腎小球基底膜增厚，系膜基質明顯增寬，尿白蛋白排泄率明顯增加，血肌酐水平增高，表明大鼠糖尿病腎病模型已成功建立。2、大鼠糖尿病腎病腎內TGF β／Smad信

5、號蛋白的活化狀態(tài)。與對照組大鼠相比，糖尿病大鼠腎臟組織內TGF-β 1、Smad2和Smad3 mRNA水平顯著增高。正常大鼠腎小管上皮細胞有p-Smad2／3的基礎表達，隨著糖尿病病情的進展，p-Smad2／3在糖尿病形成后6周顯著增高，高峰出現在8周和16周。3、大鼠糖尿病腎病腎小管上皮細胞轉分化。 第二節(jié)　兩種糖尿病動物模型腎組織中Smad蛋白活化狀態(tài)的對比研究 目的：對比兩種糖尿病腎病動物模型腎組織中Smad蛋白

6、活化狀態(tài)。方法： 1、動物分組：將40只雄性SD大鼠(160-210g)隨機分成4組，A組：正常對照組(Con組,n=8)，注射枸櫞酸緩沖液；B組：單腎切除組(Nx組，n=8)，大鼠接受右側腎切除術，2周后腹腔注射枸櫞酸緩沖液；C組：糖尿病腎病組(DM組，n=12)，單劑量腹腔注射STZ(60 mg／kg體重)：D組：單腎切除+糖尿病組(DMNx組，n=12)，大鼠接受右側腎切除術，2周后單劑量腹腔注射STZ(50mg／kg體重

7、)。觀察16周后收集標本。2、檢測指標：觀察大鼠一般情況，各組大鼠測體重、腎重、血糖、血壓、尿白蛋白排泄率、血肌酐，24小時尿量；留取各組大鼠腎組織做PAS及Masson染色；用RT-PCR檢測各組大鼠腎組織TGF-β<,1>、Smad2、Smad3、α-SMA、E-cadherin mRNA水平；免疫組織化學檢測各組大鼠腎組織中p-Smad2／3、α-SMA和E-cadhefin的表達；Western-blot檢測各組大鼠腎組織α-S

8、MA和E-cadherin的蛋白表達水平。結果：1、兩種糖尿病腎病動物模型一般情況的比較。與DM組相比較，DMNx組大鼠腎重／體重比值增加，系膜基質明顯增多，尿白蛋白排泄率明顯增加。DMNx組大鼠腎小管間質出現局灶性纖維化。但兩組之間的血壓，血肌酐水平差異無顯著性。2、兩種糖尿病動物模型腎組織中Smad蛋白活化狀態(tài)的比較。與Con組及Nx組相比較，DM組與DMNx組大鼠腎臟組織中。TGF-β<,1>、Smad2和Smad3 mRNA的表

9、達水平均顯著增高，且DMNx組較DM組升高更明顯。與Con組及Nx組相比較，DM組與。DMNx組大鼠腎小管上皮細胞p-Smad2／3的蛋白表達水平顯著增高，且DMNx組較DM組升高更明顯。3、兩種糖尿病動物模型腎小管上皮細胞轉分化的比較。與Con組及Nx組相比較，DM組與DMNx組大鼠腎臟組織中α-SMAmRNA的表達水平均顯著增高，且DMNx組較DM組升高更明顯；而E-cadherin mRNA的表達水平顯著降低，且DMNx組較DM組

10、降低更明顯。免疫組織化學及Westernblot結果表明，與Con組及Nx組相比較，DM組與DMNx組大鼠腎小管上皮細胞α-SMA的蛋白表達水平顯著增高，且DMNx組較DM組升高更明顯；而E-cadherin的蛋白表達水平顯著降低，且DMNx組較DM組降低更明顯。結論：單腎切除后STZ誘導的糖尿病腎病模型與單純STZ誘導的糖尿病腎病模型均存在Smad信號蛋白的活化及腎小管上皮細胞轉分化，且前者的活化程度及轉分化程度均強于后者。

11、第二章TGF-β<,1>和高糖對腎小管上皮細胞Smad信號蛋白的影響 第一節(jié)TGF-β<,1>對近端腎小管上皮細胞Smad信號蛋白的影響 目的：探討TGF-β<,1>對近端腎小管上皮細胞Smad信號蛋白的影響。方法：1、細胞培養(yǎng)：待生長狀況良好的NRK52E細胞60-80％貼壁后，無血清培養(yǎng)基同步24小時，然后給予不同濃度和時間TGF-β<,1>刺激。2、指標檢測：采用免疫細胞化學方法檢測0、2、4、8、10ng／m

12、l的TGF-β<,1>濃度刺激30分鐘，以及TGF-β<,1>(10ng／ml)刺激0、15min、30min、lh、3h后p-Smad2／3核轉位情況；RT-PCR檢測0h、6h、12h、24h、48h、72h，120不同時間點Smad2、Smad3、α-SMA、E-cadherin和Collagen I mRNA的表達；Western blot方法檢測Oh、24h、48h、72h不同時間點α-SMA、E-cadherin蛋白的表達水

13、平。結果：與刺激前比較，TGF-β<,1>以時間和劑量依賴方式上調NRK52E細胞p-Smad2／3核轉位，高峰發(fā)生在30min(73.1％VS 15.8％陽性細胞百分數)；與刺激前比較TGF-β<,1>以時間依賴方式上調Smad2、Smad3、Smad7和Collagen I mRNA的表達，上調α-SMA mRNA和蛋白的表達，下調E-Cadherin mRNA和蛋白的表達。結論：TGF-β<,1>能活化近端腎小管上皮細胞Smad信

14、號蛋白，并促進腎小管上皮細胞轉分化和細胞外基質的生成。 第二節(jié) 高糖對近端腎小管上皮細胞Smad信號蛋白的影響 目的：探討高糖對近端腎小管上皮細胞Smad信號蛋白的影響。方法：1、細胞培養(yǎng)：待生長狀況良好的NRK52E細胞60-80％貼壁后，無血清培養(yǎng)基同步24小時，然后分高糖組(35mmol／L)和甘露醇對照組(35mmol／L)。2、指標檢測：采用細胞免疫化學方法檢測5.5、15、25、35、45mmol／L不同葡萄

15、糖濃度刺激24h，以及高糖刺激0、15min、30min、lh、3h、6h、12h、24h、48h后p-Smad2／3核轉位情況；RT-PCR檢測Oh、12h、24h、48h、72h不同時間點Smad2、Smad3、Smad7、TGF-β<,1>、α-SMA、E-cadherin和Collagen I mRNA的表達。結果：與刺激前和甘露醇對照組比較，高糖明顯上調NRK52E細胞p-Smad2／3核轉位，高峰在24小時；上調Smad2、

16、Smad3、Smad7、TGF-β<,1>、α-SMA和CollagenI mRNA的表達；下調E-Cadherin mRNA的表達。結論：高糖能活化近端腎小管上皮細胞Smad信號蛋白，并促進腎小管上皮細胞轉分化和細胞外基質的生成。 第三章Smad7對高糖介導腎小管上皮細胞轉分化和細胞外基質合成的影響 目的：探討Smad7對高糖介導腎小管上皮細胞轉分化的影響。方法：1、強力霉素(Dox)調控Smad7表達NRK52E細

17、胞株的構建：應用lipofect 2000將含有小鼠全長Smad7 cDNA的Tet-on質粒系統(tǒng)先后轉染至正常大鼠近端腎小管上皮細胞(NRK52E)，G418培養(yǎng)基和含有潮霉素的培養(yǎng)基兩輪篩選后，最后通過鑒定選擇Smad7表達受Dox調控的克隆，擴增后凍存?zhèn)溆谩?、細胞培養(yǎng)：待生長狀況良好的轉染Smad7的NRK52E細胞株60％-80％細胞貼壁后，無血清培養(yǎng)基同步24小時，然后分為Dox誘導組和對照組，前者給予Dox(2ug／m1)

18、誘導24h后，給予高糖刺激，后者不加Dox誘導。3、指標檢測：采用免疫細胞化學方法檢測高糖刺激0、24h后p-Smad2／3核轉位情況；RT-PCR檢測Oh、12h、24h、48h、72h不同時間點Smad2、Smad3、Smad7、TGF-β1、α-SMA、E-cadherin和Collagen ImRNA的表達；Western blot方法檢測Oh、48h、72h不同時間點α-SMA、E-cadherin和Collagen I蛋白的