1、由于脊髓容易受到各種生物和理化因素的損傷，而神經(jīng)細(xì)胞損傷后的再生能力極差，因而，一般認(rèn)為，脊髓損傷（spinal cord injury，SCI）造成病人局部神經(jīng)功能損害甚至四肢癱瘓，表現(xiàn)為大小便失禁和損傷平面以下的感覺(jué)、運(yùn)動(dòng)等功能永久性缺失。SCI之后的功能缺失是主要是因?yàn)檩S突受到破壞，神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞死亡還有脫髓鞘變化等所致。而目前臨床上對(duì)SCI的治療缺少有效的方法，藥物治療主要應(yīng)用大劑量的類(lèi)固醇激素及支持療法等；外科治療主要是恢復(fù)

2、脊柱的穩(wěn)定性和椎管減壓手術(shù)等。 近年來(lái)，神經(jīng)干細(xì)胞移植的興起為SCI后的神經(jīng)功能修復(fù)提供了新的治療方法。新近的神經(jīng)細(xì)胞移植實(shí)驗(yàn)表明細(xì)胞用于治療脊髓損傷療效明顯，細(xì)胞移植療法不僅替換了受損神經(jīng)細(xì)胞，還分泌了細(xì)胞生長(zhǎng)必不可少的神經(jīng)因子并限制了膠質(zhì)瘢痕的生長(zhǎng)，因而將種子細(xì)胞在體外擴(kuò)增后進(jìn)行細(xì)胞移植是目前修復(fù)脊髓損傷最有希望的手段之一。 雪旺細(xì)胞（Schwann cells，SCs）是構(gòu)成了周?chē)窠?jīng)髓鞘的重要細(xì)胞，SCs在外周神

3、經(jīng)再生中起關(guān)鍵作用。SCs作為種子細(xì)胞之一，取材方便，來(lái)源廣泛，遺傳性狀穩(wěn)定，是最前應(yīng)用于SCI移植修復(fù)的細(xì)胞之一，已有部分實(shí)難表明，在脊髓損傷之后，位于周?chē)窠?jīng)系統(tǒng)的SCs可遷移到受損部位，參與脊髓修復(fù)的過(guò)程。此外，SCs具有許多功能，包括①分泌神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子如神經(jīng)生長(zhǎng)因子，腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子等；②生產(chǎn)和釋放細(xì)胞外基質(zhì)分子，如層粘連蛋白； ③促進(jìn)損傷后的軸突再生，引導(dǎo)軸突長(zhǎng)進(jìn)中央束并髓鞘化；④保護(hù)受損神經(jīng)元，改

4、善微循環(huán)。 而另一方面，細(xì)胞移植后如何在體內(nèi)轉(zhuǎn)歸仍然通過(guò)處死動(dòng)物后行組織免疫學(xué)的方法確定，移植后細(xì)胞的存活，分布，遷移，分化無(wú)法得到無(wú)創(chuàng)的實(shí)時(shí)的有效的監(jiān)測(cè)，因而尚無(wú)法在臨床上進(jìn)行評(píng)價(jià)。目前，得益于磁共振成像（MRI）的分子影像學(xué)的快速發(fā)展，細(xì)胞移植后的無(wú)創(chuàng)的活體示蹤成為可能。超小順磁性氧化鐵（USPIO）Sinerem作為一種新型的磁共振造影劑，已獲得FDA的批準(zhǔn)，并已成功應(yīng)用于多種細(xì)胞的標(biāo)記。本課題組已將其應(yīng)用于雪旺細(xì)胞SCs

5、的研究，并取得肯定的效果。而到目前為止，Sinerem對(duì)SCs的生物學(xué)影尚無(wú)系列的相關(guān)報(bào)道，本課題旨在體外通過(guò)多種方法研究標(biāo)記前后的SCs的細(xì)胞活力，增殖能力以及凋亡等情況，力求探索標(biāo)記SCs的適宜濃度，為SCs移植治療SCI模型的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)及相關(guān)的技術(shù)參考。 第一部分 低濃度胰酶多次差速酶消培養(yǎng)和純化乳鼠雪旺細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究。 目的：觀察SCs體外培養(yǎng)，純化及傳代的情況，熟練掌握細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，為下一步實(shí)驗(yàn)奠定基

6、礎(chǔ) 方法：取新生3-5d的SD乳鼠，無(wú)菌條件下解剖后取出雙側(cè)臂叢及坐骨神經(jīng)，制成單細(xì)胞懸液后以3×105個(gè)/ml的細(xì)胞懸液接種于預(yù)鋪PLL過(guò)夜的25c㎡培養(yǎng)瓶中。用低濃度胰酶多次差速酶消純化SCs，在倒置的相差顯微鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)和數(shù)量等生長(zhǎng)情況。采用免疫熒光法鑒定，P75NTR是SCs的細(xì)胞表面分子，利用其對(duì)SCs的特異性鑒別。 結(jié)果：SCs接種后，主要以單個(gè)圓形漂浮的細(xì)胞為主，少數(shù)細(xì)胞聚集成團(tuán)塊狀；24 h后，大部

7、分細(xì)胞已貼壁，其中較多的細(xì)胞可見(jiàn)明顯的突起伸出，體積較小，可見(jiàn)細(xì)胞呈雙極狀，立體感較強(qiáng)：繼續(xù)培養(yǎng)，軸突變長(zhǎng)，72h后細(xì)胞間軸突相連，相互纏繞交匯成網(wǎng)狀；同時(shí)可見(jiàn)另一種細(xì)胞，體積較大，形態(tài)不規(guī)則，色澤黯淡的細(xì)胞鋪在下面；用低濃度消化酶純化后細(xì)胞排列規(guī)則，緊密有序，或成直線，或相互平行，呈柵欄狀，紡綞狀或漩渦狀排列；細(xì)胞形態(tài)單一，只有極少數(shù)體積較大的扁平細(xì)胞。高倍鏡下可見(jiàn)SCs瘦長(zhǎng)，胞體周?chē)忻髁恋墓鈺?，中間圓兩頭尖，兩側(cè)伸出兩個(gè)到三個(gè)長(zhǎng)長(zhǎng)

8、的軸突，細(xì)胞與細(xì)胞之間通過(guò)軸突相連。 P75NTR是特異性地標(biāo)記SCs，在熒光顯微鏡下，陽(yáng)性細(xì)胞被激發(fā)后發(fā)出紅色熒光。證實(shí)培養(yǎng)出來(lái)的細(xì)胞是特異性表達(dá)P75的細(xì)胞，免疫熒光可見(jiàn)P75的表達(dá)。 結(jié)論：乳鼠SCs能在體外進(jìn)行培養(yǎng)和擴(kuò)增，生長(zhǎng)增殖能力較旺盛，能特異性地表達(dá)P75，是進(jìn)行脊髓損傷修復(fù)的種子細(xì)胞之一。 低濃度胰酶多次差速酶消純化乳鼠SCs方法，無(wú)須添加特殊的試劑和藥物，操步驟相對(duì)比較簡(jiǎn)單，實(shí)驗(yàn)重復(fù)性強(qiáng)，提純

9、的SCs可達(dá)到95%以上，是一種安全快速，簡(jiǎn)單有效的細(xì)胞培養(yǎng)方法。 第二部分 超小超順磁性氧化鐵Sinerem對(duì)大鼠雪旺細(xì)胞生物學(xué)活性影響。 目的：應(yīng)用超小超順磁性氧化鐵（USPIO）Sinerem和轉(zhuǎn)染試劑多聚賴(lài)氨酸（PLL）復(fù)合物標(biāo)記乳鼠雪旺細(xì)胞，初步評(píng)價(jià)Sinerem安全性及合適的標(biāo)記濃度，為今后的進(jìn)一步研究工作提供技術(shù)參考。 方法：取SD乳鼠坐骨神經(jīng)和臂叢神經(jīng)，用膠原酶消化后進(jìn)行原代培養(yǎng)，并用超低濃度胰酶

10、提純，將制備的不同濃度的Sinerem-PLL復(fù)合物和雪旺細(xì)胞共孵育培養(yǎng)48h；細(xì)胞的生長(zhǎng)情況通過(guò)倒置的相差顯微鏡觀察，氧化鐵顆粒在胞內(nèi)的存在通過(guò)普魯斯藍(lán)染色及透射電鏡證實(shí)，細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡通過(guò)流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析比較，細(xì)胞生長(zhǎng)增殖影響通過(guò)CCK-8法檢測(cè)，細(xì)胞掃描用3.0T MR在體外進(jìn)行數(shù)列分析。 結(jié)果：普魯士藍(lán)染色和透射電鏡觀察顯示細(xì)胞質(zhì)內(nèi)有鐵顆粒存在；CCK-8法檢測(cè)結(jié)果表明，100μg/ml～800μg/ml不同濃度范

11、圍的sinerem對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)增殖的影響差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示，500μg/ml的sinerem對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)周期及細(xì)胞凋亡和死亡的沒(méi)有明顯的影響。 結(jié)論： 1.不同濃度的Sinerem-PLL復(fù)合物可以用來(lái)體外標(biāo)記乳鼠SCs。 2.隨Sinerem濃度的增高，其標(biāo)記效率亦增高，且標(biāo)記后T2 WI信號(hào)改變愈明顯。濃度在800μg/ml以下時(shí)，應(yīng)用Sinerem-PLL復(fù)合物標(biāo)記SCs安全、有效。