1、本論文包括文獻(xiàn)研究和實(shí)驗(yàn)研究兩個(gè)部分。文獻(xiàn)研究通過大量的文獻(xiàn)資料,系統(tǒng)回顧了雪旺細(xì)胞體外培養(yǎng)的方法,并對重組腺病毒表達(dá)載體和腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子的研究進(jìn)展進(jìn)行總結(jié)和分析。通過分析既往雪旺細(xì)胞體外培養(yǎng)和基因轉(zhuǎn)染方法中存在的主要問題,設(shè)想將編碼神經(jīng)營養(yǎng)因子的基因片斷通過腺病毒載體導(dǎo)入雪旺細(xì)胞即可以實(shí)現(xiàn)目的基因的持續(xù)、穩(wěn)定表達(dá),探索基因治療外周神經(jīng)損傷的新途徑。周圍神經(jīng)損傷后的修復(fù)與再生是多因子、多因素參與的生理過程,補(bǔ)充單一因子對神經(jīng)再生的作

2、用非常有限。周圍神經(jīng)損傷癥狀屬于祖國醫(yī)學(xué)中的痿癥和痹癥,且中藥正是一種多因素復(fù)合物,有可能提供更多、比例更接近神經(jīng)生理需求與生長活性因子的環(huán)境,有其獨(dú)特優(yōu)勢,此實(shí)驗(yàn)的成功為日后結(jié)合傳統(tǒng)中醫(yī)的整體觀促進(jìn)神經(jīng)損傷的恢復(fù)提供了良好的基礎(chǔ)。實(shí)驗(yàn)研究目的:通過聯(lián)合運(yùn)用多種方法在短時(shí)間內(nèi)獲得數(shù)量多、純度高的雪旺細(xì)胞,用攜帶腦源性神經(jīng)生長因子基因的重組腺病毒載體轉(zhuǎn)染雪旺細(xì)胞。探討應(yīng)用重組腺病毒載體攜帶腦源性神經(jīng)生長因子基因轉(zhuǎn)染雪旺細(xì)胞的可行性及促進(jìn)外

3、周神經(jīng)損傷恢復(fù)的有效途徑。方法:采取6-7 d SD乳鼠坐骨神經(jīng),利用酶消化法、差速貼壁法分離獲得雪旺細(xì)胞、Ara-C與G418聯(lián)合應(yīng)用以去除成纖維細(xì)胞、牛腦垂體提取物(BPE)以促進(jìn)雪旺細(xì)胞增殖,以及采用低濃度胰酶消化法傳代等一系列步驟,獲取大量高純度的雪旺細(xì)胞。為探討B(tài)PE對體外培養(yǎng)雪旺細(xì)胞增殖作用的影響以及確定BPE應(yīng)用的最佳濃度,將第二代雪旺細(xì)胞分為五組,分別加入不同濃度的BPE(50μg/ml、100μg/ml、150μg/m

4、l、200μg/ml),并以不加BPE作為對照。在加入BPE后于第二、四、六、八天每組分別作S-100蛋白相關(guān)抗原免疫細(xì)胞化學(xué)染色,對雪旺細(xì)胞、成纖維細(xì)胞分別計(jì)數(shù),進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。將重組腺病毒載體感染HEK293細(xì)胞,待CPE現(xiàn)象明顯時(shí)采用反復(fù)凍融法收獲病毒,然后將收獲的病毒再次感染HEK293細(xì)胞,收獲病毒,重復(fù)三次。對最后一次收獲的病毒采用噬斑檢測法(plaque assay)進(jìn)行滴度測定。使用含有人BDNF基因的重組腺病毒載體,經(jīng)

5、不同感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection, MOI)病毒量感染體外培養(yǎng)的大鼠源性SC。RT-PCR和Western blot檢測感染后72 h的感染效率,進(jìn)一步用高感染效率下的MOI病毒量感染SC, ELISA定量分析感染后3d、6d、9d、12d、15d、18d和21d時(shí)在感染后SC培養(yǎng)液上清中BDNF的表達(dá)。結(jié)果:經(jīng)形態(tài)學(xué)及S-100蛋白相關(guān)抗原免疫細(xì)胞化學(xué)染色鑒定證實(shí)所獲得的雪旺細(xì)胞狀態(tài)較好,純度較高,可達(dá)

6、90％以上。BPE對雪旺細(xì)胞有明顯促增殖作用;當(dāng)BPE濃度為100μg/ml時(shí),對成纖維細(xì)胞分裂影響較小同時(shí)對雪旺細(xì)胞保持了有效的促增殖作用。三輪病毒擴(kuò)增后Ad-BDNF滴度為:1.78×109pfu/ml。重組腺病毒感染SC后72 h時(shí),以MOI為200感染組的感染效率最高。進(jìn)一步以MOI為200的病毒量感染SC,ELISA結(jié)果表明,在各時(shí)間點(diǎn)時(shí),感染后SC培養(yǎng)液上清中的BDNF表達(dá)量均明顯高于正常SC。結(jié)論:通過將酶消化法、差速貼壁

7、法、Ara-C與G418、BPE及低濃度胰酶消化法聯(lián)合運(yùn)用可以在短時(shí)間內(nèi)獲得純度高、狀態(tài)好的原代培養(yǎng)雪旺細(xì)胞。適當(dāng)濃度的牛腦垂體提取物(BPE)可以有效的促進(jìn)雪旺細(xì)胞增殖。使用HEK293細(xì)胞擴(kuò)增腺病毒載體可以在短時(shí)間內(nèi)獲得高滴度的腺病毒載體。Ad-BDNF感染后SC能夠?qū)⒅亟M腺病毒介導(dǎo)的外源性BDNF基因通過轉(zhuǎn)錄翻譯,最終表達(dá)的BDNF量高于正常SC,并且能夠維持較長時(shí)間。此為應(yīng)用重組腺病毒載體攜帶腦源性神經(jīng)生長因子基因轉(zhuǎn)染雪旺細(xì)胞促