1、目的:
　?、蛐涂缒そz氨酸蛋白酶(TypeⅡTransmembrane Serine Protease,TTSPs)是一類通過氨基末端跨膜區(qū)域錨定在細胞膜上的蛋白酶,在哺乳動物的許多病理、生理過程中扮演著重要的角色,其功能異常可導致癌癥、缺鐵性貧血、耳聾、心血管疾病等。在人類,TTSPs共有17個成員,其中對matriptase-2的研究比較少,目前對其生物學功能的了解,主要是它可以通過調控hepcidin的表達來調節(jié)體內鐵穩(wěn)態(tài);

2、除此之外,有研究表明它在乳腺癌和睪丸癌的發(fā)生發(fā)展過程中也起到一定的作用,但在這些疾病的發(fā)生發(fā)展中,matriptase-2的具體生物學功能并不明確。目前已知,matriptase-2的活化和胞外段脫落是其發(fā)揮自身功能的前提條件,但是對于調節(jié)matriptase-2表達,活化和胞外段脫落(酶切)的分子機制仍不清楚。本研究旨在探究調節(jié)matriptase-2的表達,活化以及胞外段脫落(酶切)的分子學機制。
　　方法:
　　(1)

3、利用RT-PCR,PCR從人肝臟組織中提取出matriptase-2基因,然后連接到帶有V5標簽的真核表達質粒中;
　　(2)matriptase-2重組質粒轉染HEK293和肝癌細胞,然后利用細胞免疫熒光技術檢驗matriptase-2在這些細胞中能否成功表達;
　　(3)免疫共沉淀收集條件培養(yǎng)基中的可溶性matriptase-2片段;
　　(4)用生物素標記和免疫共沉淀分離、提取膜蛋白;
　　(5)利用蛋白酶

4、抑制劑,免疫共沉淀以及western blot探究哪類蛋白酶抑制劑能抑制matriptase-2胞外段脫落;
　　(6)利用點突變阻斷對matriptase-2活性至關重要的兩個位點,用來探究matriptase-2能否自身活化;同樣地,利用點突變分別阻斷matriptase-2上的七個糖基化修飾位點,用來研究各個糖基化位點對matriptase-2的表達,活化和胞外段脫落(酶切)的影響;
　　(7)Western blot

5、分析matriptase-2在細胞裂解液,上清以及膜蛋白中的表達,活化以及胞外段脫落情況;
　　結果:
　　(1)利用RT-PCR和PCR成功從人肝組織中提取到matriptase-2 cDNA,連接到帶有V5標簽的質粒后,經測序所有的堿基序列與人matriptase-2基因序列保持一致。
　　(2)重組matriptase-2質粒轉染到人胚腎細胞HEK293和肝癌細胞BEL7402后,利用細胞免疫熒光檢測到錨定于細胞

6、膜上的matriptase-2,這表明我們所建立的細胞模式很成功,能夠用于以后的實驗。
　　(3)用Western blot和免疫共沉淀分析matriptase-2在HEK293和肝癌細胞(BEL-7402、SMMC-7721、QGY-7703)中的活化情況。結果表明matriptase-2在HEK293細胞中的活化和胞外段脫落(酶切)情況與在肝癌細胞中是一致的;其中~30 kDa條帶為matriptase-2的活化條帶。

7、　　(4)利用免疫共沉淀和western blot,檢測在條件培養(yǎng)基中加入各種蛋白酶抑制劑(GM6001、ALLM、benzamidine(benz)、TAPI-1)后,上清中是否存在可溶性Matriptase-2片段。結果顯示,在加入絲氨酸蛋白酶抑制劑(benzamidine)后,條件培養(yǎng)基(opti-MEM,沒有血清的培養(yǎng)基)中的可溶性matriptase-2均顯著減少;而加入其它蛋白酶抑制劑后,條件培養(yǎng)基中的matriptase-

8、2保持不變。
　　(5)利用點突變得到致使matriptase-2失去活性的R576A和S762A(R576—活化酶切位點被突變掉;S762A—催化區(qū)中對自身活性至關重要的一個位點被突變掉)。然后,通過 western blot檢測這兩個突變體的條件培養(yǎng)基中是否存在可溶性matriptase-2片段。結果顯示,兩個突變體的條件培養(yǎng)基(opti-MEM,沒有血清的培養(yǎng)基)中均沒有可溶性matriptase-2片段。
　　(6)

9、利用生物素標記提取膜蛋白,然后western blot分析matriptase-2在細胞膜上的活化情況。結果顯示,在表達野生型matriptase-2的HEK293和BEL7402的膜蛋白中,檢測到~30 kDa的條帶;在表達matriptase-2的兩個突變體(R576A、S762A)的膜蛋白中,沒有檢測到~30 kDa的條帶。~30 kDa條帶為matriptase-2的活化條帶。
　　(7)利用western blot分析m

10、atriptase-2的糖基化修飾類型。結果顯示,在加入PNGase F的細胞裂解液中,matriptase-2的分子量下降;加入O-glycanase的細胞裂解液中,matriptase-2的分子量沒有變化;而在加入PNGase F+O-glycanase的細胞裂解液中,matriptase-2的分子量亦下降,鑒于糖基化修飾分為N-糖基化修飾和O-糖基化修飾,故而我們得出matriptase-2的糖基化修飾主要是N-糖基化修飾。

11、>　　(8)利用點突變分別阻斷matriptase-2的七個糖基化修飾位點,得到N136Q、N184Q、N216Q、N338Q、N433Q、N453Q、N518Q七個突變體,然后通過免疫共沉淀和western blot分析這七個糖基化修飾位點對其表達,活化和胞外段脫落(酶切)的影響。結果表明這些糖基化修飾位點并不影響matriptase-2表達以及在細胞膜上的錨定。然而,N216Q、N453Q和N518Q卻能明顯抑制matriptase

12、-2的活化,進而阻止了matriptase-2從細胞膜上的脫落(酶切),而其他5個突變體并沒有影響到matriptase-2的活化和酶切。
　　結論:我們比較系統(tǒng)全面地研究了matriptase-2在HEK293和肝癌細胞中的活化和酶切情況,我們發(fā)現(xiàn)matriptase-2在胞漿中無法被活化,但是錨定在膜上后可以通過自我酶切使自身活化,并且活化的matriptase-2可以酶切自身進而與胞膜脫落。我們也發(fā)現(xiàn)了N-糖基化修飾對mat