1、γδT細胞兼具特異性和非特異性免疫應答雙重特征，其在機體免疫應答中所處的進化地位和生物學意義與功能有待于進一步闡明。因此，揭示γδ抗原識別受體(TCR)抗原識別的規(guī)律，將有助于對上述理論問題進行澄清，并可為免疫學應用提供新的策略與手段。 本論文旨在研究γδT細胞對熱休克蛋白(HSP)的識別機制和探討乙型肝炎病毒感染患者TCRVδ2的抗原識別機理，以及以TCRCDR3δ為探針篩選和鑒定γδTCR識別的表位多肽。 (一)人類

2、γδT細胞對細胞表面熱休克蛋白(membraneHSPs)識別機制的研究熱休克蛋白在免疫應答中主要作用包括：1)與表位肽形成HSPs-peptide復合物，表達在細胞表面，參與抗原提呈過程；2)作為靶分子直接為免疫細胞所識別，誘導產(chǎn)生免疫應答。針對上述問題，本文首先重點研究了在γδT細胞識別HSP分子的過程中，HSP分子究竟是作為抗原提呈分子還是作為抗原這一基本問題，繼而初步探討了HSP分子和γδT細胞相互作用的生物學意義。為此，首先我

3、們以EB病毒(EBV)轉(zhuǎn)化B淋巴細胞(LCL細胞)作為細胞模型，探討了細胞轉(zhuǎn)化這一應激事件對細胞膜表面HSP分子表達水平的影響；其次應用siRNA干擾技術，分別敲除HSP60和HSP70分子，觀察LCL細胞上述基因表達水平與γδT細胞對LCL細胞毒活性間的相關性；最后，利用體外增殖實驗，探討HSP分子是否對γδT細胞具有直接刺激作用。研究結(jié)果顯示，在LCL細胞表面，HSP60和HSP70分子均可在轉(zhuǎn)化應激的誘導下表達增高。HSP70分子

4、表達下調(diào)后，γδT細胞對自體和異體來源的LCL細胞毒活性均受到抑制，與對照組相比具有顯著統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，而HSP60分子表達水平對γδT細胞殺傷活性的影響較小。[3H]-TdR摻入實驗證實了HSP72分子可以直接刺激γδT細胞發(fā)生增殖。上述結(jié)果不僅在理論上支持了γδT細胞通過直接識別HSP分子參與早期免疫應答，尤其在對腫瘤的免疫監(jiān)視，同時也為以HSP70分子(尤其是HSP72分子)為佐劑，輔助γδT細胞介導的免疫治療提供了依

5、據(jù)。目前，上述結(jié)果所形成的論文已被“ImmunologicalInvestigations”接收。 (一)HBV慢性感染患者TCRVδ2抗原識別的結(jié)構(gòu)基礎與相應抗原識別表位多肽的篩選與鑒定 其具體研究內(nèi)容為：γδTCR中δ鏈的CDR3區(qū)在抗原識別中的作用，并分析其中的關鍵序列；然后利用人工合成的CDR3δ多肽在噬菌體肽庫篩選相應的抗原表位多肽。 我們首先選擇慢性HBV慢性感染(CHB)患者作為研究對象，通過RT-

6、PCR，從CHB患者外周血的γδT細胞中，擴增其抗原識別受體(γδTCR)V區(qū)并進行測序。通過與GenBank現(xiàn)有序列對比進行分析，了解CHB患者外周血γδTCRV區(qū)序列特征。結(jié)果提示CHB患者TCRVδ2CDR3長度保守；基因組成以V1D3J1為主，其中D3片段讀碼框優(yōu)勢取用“LGDT”；而在N/P位點中，F(xiàn)-7位中性氨基酸(GAVLI)的取用少于對照組。 其次，我們利用人工合成CHB患者來源的CDR3δ肽，研究其與HBV感染

7、肝組織或者HBV感染肝細胞模型的結(jié)合特異性。結(jié)果表明，含有保守序列的CDR3δ合成肽(CH1)可以與HBV感染肝組織以及HBV感染肝細胞模型2.2.15細胞發(fā)生特異性結(jié)合，而與正常肝組織則無結(jié)合反應。為進一步研究組成CDR3δ的各基因片段的編碼產(chǎn)物(V、D和J片段)在抗原識別中的作用，我們合成了用隨機序列替換上述片段的對照肽Vm、Dm、Jm和VJm。通過激光共聚焦顯微鏡分析和SPR技術分析，發(fā)現(xiàn)Vm和VJm突變肽幾乎不與2.2.15細胞

8、結(jié)合，而Dm和Jm與2.2.15細胞的結(jié)合水平與CH1基本相當。這一結(jié)果提示CDR3δ的側(cè)翼序列在抗原識別中起決定性作用。 最后，我們以CDR3δ合成肽為探針，在噬菌體展示肽庫(Ph.D.-12TMPhageDisplayPeptideLibrary)中進行了抗原表位多肽的篩選，獲得了八條特異結(jié)合的肽片段。經(jīng)過ELISA驗證和生物信息學分析，選擇合成了其中兩條進行了初步的功能研究。這兩條多肽的序列分別為“WHWTNWGKTSPA