1、孢子絲菌病是一種皮膚、皮下組織及其附近淋巴系統(tǒng)的亞急性或慢性真菌感染，有時可波及各臟器。其致病菌申克孢子絲菌(Sporothrix schenckii，簡稱Sschenckii)廣泛存在于自然界，尤其是熱帶和亞熱帶地區(qū)，中國亦為高發(fā)地區(qū)。 S．schenckii的形態(tài)特征是與其它雙相型真菌鑒別的重要依據(jù)，同時與其致病性關(guān)系密切。其在25℃生長狀態(tài)為菌絲相，表現(xiàn)為淡褐色至深褐色或黑色菌落，有皺褶或溝紋，可見灰白色短絨毛狀菌絲，鏡

2、下可見纖細(xì)分支分隔菌絲，生孢子梗位于菌絲兩側(cè)直角長出，呈梅花朵樣或“套袖”狀排列；37℃為酵母相，表現(xiàn)為白色至灰黃色酵母樣菌落，鏡下可見圓形、長形或者梭形孢子，有出芽。雙相型轉(zhuǎn)化是S．schenckii的重要特征之一，轉(zhuǎn)化條件較復(fù)雜，存在菌株特異性，并且與菌株的毒力相關(guān)。S．schenckii侵入宿主后，通過一系列的形態(tài)學(xué)改變來適應(yīng)宿主的內(nèi)環(huán)境，造成組織損傷，抵抗宿主免疫殺傷。目前大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為酵母相是S．schenckii的致病形態(tài)。

3、 孢子絲菌病呈慢性病程，發(fā)病部位皮膚組織纖維化導(dǎo)致其治療周期長，費(fèi)用高，而且已有對兩性霉素B治療失敗的報道，亦有對伊曲康唑MIC值較高的報道，因此有必要進(jìn)行體外藥敏試驗(yàn)及耐藥菌株的臨床監(jiān)測?！睹绹鴤魅静f(xié)會2007版孢子絲菌病臨床治療指南》推薦，伊曲康唑作為非系統(tǒng)性孢子絲菌病的首選單獨(dú)治療藥物，很多學(xué)者亦嘗試了聯(lián)合治療，并取得一定療效。而與之相關(guān)的體外藥敏試驗(yàn)仍處于探索階段，由于影響因素較多，哪一種生長形態(tài)的藥敏試驗(yàn)結(jié)果更為準(zhǔn)確

4、可靠、并用以指導(dǎo)該病治療尚存爭議。目前尚無S．schenckii對伊曲康唑耐藥的報道，亦無相關(guān)藥敏試驗(yàn)?zāi)退帢?biāo)準(zhǔn)的報道，對其耐藥機(jī)制需進(jìn)一步探討。 盡管很多學(xué)者通過建立動物模型的方式，對S．schenckii的致病性、宿主免疫反應(yīng)及治療方面進(jìn)行了探討，但迄今為止仍未有明確的闡述。動物模型的建立是由宿主和受試菌株共同決定的，影響因素較多，既往文獻(xiàn)報道動物模型多是在免疫抑制基礎(chǔ)上建立的，既不能反應(yīng)疾病的自然進(jìn)程，也不能反應(yīng)宿主的正常免

5、疫作用。因此建立理想的孢子絲菌菌病動物模型，模擬自然發(fā)病過程，對該疾病發(fā)病機(jī)制的闡明及治療藥物的療效評價具有重要意義。本課題擬通過對分離自1例伊曲康唑治療失敗的孢子絲菌病患者的臨床菌株SUMS0382的生物學(xué)特性及所建立的相應(yīng)慢性皮膚感染動物模型進(jìn)行研究，有助于闡述S．schenckii的致病性。 第一部分：SUMS0382申克孢子絲菌的生物學(xué)特性研究 目的：探討SUMS0382申克孢子絲菌的酵母相轉(zhuǎn)化條件、生長抑制溫度

6、及體外藥敏試驗(yàn)，進(jìn)一步明確其真菌生物學(xué)特性。 方法：1.酵母相轉(zhuǎn)化。將實(shí)驗(yàn)菌株傳代活化2次后，超凈工作臺內(nèi)，挑取生長良好的菌落團(tuán)塊，采用劃線接種法，接種于BHIA+5％羊血斜面試管和BHIA+0.5％GS余面試管，各2管，置CO2恒溫溫箱35℃培養(yǎng)。必要時連續(xù)傳代，直至轉(zhuǎn)化成功，獲得灰白色酵母型菌落。2.溫度生長抑制試驗(yàn)。將酵母相實(shí)驗(yàn)菌株，采用劃線接種法，接種于SDA平板、PDA平板、BHIA平板、BHIA+5％羊血平板和BHI

7、A+0.5％GS平板，各2個，分別置35℃、36℃、37℃和38℃CO2恒溫溫箱培養(yǎng)14d，觀察各菌株生長情況，記錄各實(shí)驗(yàn)菌株的停止生長溫度。3.伊曲康唑和特比萘芬體外聯(lián)合藥敏試驗(yàn)?；罨?，分別制備菌絲相和酵母相菌懸液，菌絲相濃度調(diào)整至5×104 CFU/ml(2倍終濃度)，酵母相調(diào)整至2.5×103 CFU/ml(2倍終濃度)；采用微量液基稀釋法加樣制板后，菌絲相置25℃，酵母相置35℃孵育，第5d觀察結(jié)果。結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)為各藥的MI

8、C終點(diǎn)為100％生長抑制，聯(lián)合用藥效果評價采用分?jǐn)?shù)抑菌濃度指數(shù)評價。4株菌均進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn)。 結(jié)果：1.通過連續(xù)傳代，成功獲取4株申克孢子絲菌的酵母相。2.SUMS0382、BMU02035和SUMS0383在35℃和37℃生長較好，36℃生長差，38℃時停止生長，BMU00471均生長良好。3.體外聯(lián)合藥敏試驗(yàn)顯示伊曲康唑和特比萘芬不論單獨(dú)應(yīng)用還是聯(lián)合應(yīng)用，菌絲相GM值均高于酵母相；兩藥相互作用結(jié)果顯示：菌絲相時，SUMS0

9、383和BMU00471顯示相加作用，SUMS0382和BMU02035顯示無關(guān)作用；酵母相時，SUMS0382、SUMS0383和BMU02035顯示相加作用，BMU00471表現(xiàn)為無關(guān)作用。 結(jié)論：1.該菌株酵母相轉(zhuǎn)化需要富含營養(yǎng)的培養(yǎng)基，連續(xù)傳代，35℃是適宜溫度。2.菌株SUMS0382的生長抑制溫度為38℃。3.生長時相對S．schenckii MIC值有明顯影響，體外聯(lián)合藥敏試驗(yàn)是可行的。 第二部分：SUMS

10、0382申克孢子絲菌慢性皮膚感染W(wǎng)istar大鼠模型的建立 目的：觀察免疫正常Wistar大鼠皮膚型孢子絲菌病的發(fā)病過程，探討其慢性皮膚感染動物模型建立的可行性及實(shí)驗(yàn)條件。 方法：1.實(shí)驗(yàn)動物。42只Wistar大鼠，雌雄各半，體重90-100g。2.實(shí)驗(yàn)性感染。采用化學(xué)脫毛法于大鼠背部脫毛，脫毛區(qū)約3cm×3cm。水合氯醛腹腔麻醉后，采用皮下注射法，在脫毛區(qū)注射孢子絲菌SUMUS0382菌懸液0.1ml，約含1×107

11、個孢子，分3點(diǎn)接種，拔針時，輕按針孔片刻，防止菌液逸出。3.發(fā)病情況觀察。自接種之日起，每日觀察大鼠的生長發(fā)育情況(體重、存活率)及發(fā)病情況(皮損形成時間，結(jié)節(jié)、糜爛、潰瘍、結(jié)痂等)，觀察時間為12w。4.組織培養(yǎng)與組織病理。接種后4w、8w、12w各取2只發(fā)病大鼠，切取結(jié)節(jié)后，分為兩部分，一部分用10％福爾馬林固定，石蠟切片，分別行HE和PAS染色，鏡下觀察組織病理變化；另一部分無菌操作下剪碎組織，接種沙氏培養(yǎng)基(SDA)和腦心浸汁羊

12、血培養(yǎng)基(BHIA)，分別置25℃和35℃培養(yǎng)。 結(jié)果：1.接種2w后可見結(jié)節(jié)長出，4w時有結(jié)節(jié)老鼠數(shù)量最多，隨后部分結(jié)節(jié)可消退，未消退者結(jié)節(jié)緩慢增大，主要局限于接種點(diǎn)。其中一只大鼠70d時皮損出現(xiàn)化膿，潰瘍。觀察期內(nèi)，所有大鼠生長發(fā)育好，未出現(xiàn)死亡。2.第4w、8w、12w皮損組織SDA25℃培養(yǎng)，可見典型菌落，且色素較原菌株加深；BHIA35℃培養(yǎng)，可見酵母型菌落。3.三個觀察時段組織病理均可見感染性肉芽腫，呈現(xiàn)典型的“三帶