1、中國醫(yī)科大學碩士學位論文端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（hTERT）在白血病中的表達及其與WT1的相關(guān)性研究姓名：劉靜申請學位級別：碩士專業(yè)：腫瘤內(nèi)科指導教師：劉云鵬20030301臨床資料1 病例選擇：選取就診于我院的7 9 例急、慢性白血j i ；{ 病人，其中男性3 9 例，女性4 0 例，年齡為L 2 至7 5 歲，3 F 均年齡4 0 ．3 歲。包括急性髓性自m 病( ^ M L ) 3 9 例，急性淋巴細胞自血病( A L l ．) 2 1

2、 例，慢性粒細胞I C I J I U 病慢f 4 ：l O ] ( C M L - c p ) 1 2 例，慢性粒細胞白血病加速／急變期( C M L - a D ) 7例。全部病例均經(jīng)骨髓形態(tài)學檢查，符合F A B 診斷標準。另選1 3 例正常人或非l f n 液系統(tǒng)疾病病人為對照，經(jīng)骨髓涂片及活鰣【織檢查未見特征性血液病改變。2 研究方法：2 ．1 單個核細胞分離：抽取肝索化骨髓或外周血3 - 5 m l ，經(jīng)淋巴細胞分離液分離單

3、個核細胞。將細胞濃度調(diào)至l X 1 0 6 ／m l ，取少量細胞經(jīng)離心制成細胞涂片。余加入T R I Z O L 裂解液于4 ℃保存?zhèn)溆谩? ．2 免疫細胞化學染色：以慢性粒細胞自『血病急性變細胞系1 ( 5 6 2 細胞為陽性對照，使用1 ：1 0 0 稀釋的h T E R 。r 兔抗人多克隆抗體( 美國S A N T AC R U Z 公司產(chǎn)品) ，S - P 免疫組化試劑盒檢測正常對照或白m 病患者骨髓或外周血標本中h T E

4、R T 表達，常規(guī)抗體稀釋液代替～抗作為陰性對照。胞核染成棕黃色為陽性。于高倍鏡下{ 1 ‘數(shù)3 0 0 個細胞，陽性細胞百分數(shù)大于2 0 ％視為陽性。2 ．3 逆轉(zhuǎn)錄一聚合酶鏈式反應( R T —P C R ) 半定量測定w T 】m R N A 水平：取于T R l Z O L 中保存的細胞，按照試劑盒說明提取總R N A 。用紫外分光光度計( 波長2 6 0 n m ) 進行F t N A 定最，逆轉(zhuǎn)錄合成c D N A 第～鏈，

5、之后參照文獻行P C R 擴增，再將擴增產(chǎn)物在1 ．3 ％瓊脂糖凝膠( 含0 ．5 u g ，／m l 溴化乙錠)中電泳( 1 0 0 V ，4 0 分鐘) ，然后用G D S 8 0 0 0 凝膠成像分析儀照相、分析。以無模板P e R 產(chǎn)物為陰性對照，B ～a c t i n 為內(nèi)部標準。t N T lm R N A 的相對表達水平用W T l 的P C R 電泳結(jié)果掃描值／p —a c t i n 的P C R 電泳結(jié)果掃描值來確