1、研究背景和目的:
　　肝細(xì)胞肝癌(HCC)是一種臨床表現(xiàn)隱匿、發(fā)展迅速和預(yù)后極差的消化道惡性腫瘤，晚期HCC的5年生存率在5％以下。由于HCC早期無(wú)明顯和特異的癥狀和體征，以及缺乏簡(jiǎn)單、可靠的診斷方法，使許多患者被誤診，嚴(yán)重影響了HCC患者的生存率。HCC的臨床治療手段主要包括手術(shù)治療、化療、放療和免疫治療等。據(jù)了解，我國(guó)約有85％的HCC患者就診時(shí)已屬晚期，僅20％左右的患者可行手術(shù)治療。然而已失去手術(shù)機(jī)會(huì)患者，有的HCC類(lèi)型對(duì)

2、放療不敏感，全身化療又難以奏效。目前尚無(wú)治療有效藥物，因此，HCC的臨床綜合治療亟待尋找新的治療方法。
　　中期因子(Midkine，MK)為一種小分子分泌性蛋白，屬肝素結(jié)合生長(zhǎng)因子家族成員，其相對(duì)分子質(zhì)量(Mr)約為14000。MK基因定位于人類(lèi)染色體11p11.2，由5個(gè)外顯子和4個(gè)內(nèi)含子構(gòu)成。MK是一種具有重要的多功能細(xì)胞因子，深入研究還發(fā)現(xiàn)MDK在多種腫瘤中如HCC、結(jié)直腸癌、膀胱癌、乳腺癌、胃癌、胰腺癌、表達(dá)顯著上調(diào)。它

3、可通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化、促進(jìn)腫瘤血管生成、促纖溶和細(xì)胞趨化、增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的耐藥性和抑制細(xì)胞凋亡等一系列作用以調(diào)節(jié)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移、耐藥等不良生物學(xué)行為。研究也表明MK在肝癌組織中高度表達(dá)，并且與肝癌侵襲、轉(zhuǎn)移和預(yù)后不良有關(guān)，有望成為新型的肝癌標(biāo)志物。而RNA干擾沉默中期因子基因表達(dá)誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡，體內(nèi)體外研究證實(shí)中期因子反義寡甘核酸能抑制肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。
　　盡管越來(lái)越多的研究提示MK在肝癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中可能起著重要的

4、作用，但是，其分子作用機(jī)理并不清楚。由于蛋白質(zhì)相互作用在生命活動(dòng)中扮演關(guān)鍵角色，因此進(jìn)一步研究MK的信號(hào)途徑即MK蛋白具體與哪些細(xì)胞因子相互作用是探明其生物學(xué)功能的重要內(nèi)容。確定MK的相互作用蛋白質(zhì)，為其在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中作用機(jī)制的闡明提供實(shí)驗(yàn)證據(jù)，為腫瘤的臨床診斷和治療開(kāi)辟一種新的研究途徑。這些闡明MK與腫瘤發(fā)生關(guān)系及內(nèi)在作用機(jī)制的系統(tǒng)研究有助于我們更好的開(kāi)發(fā)利用MK這一新的腫瘤標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)，以發(fā)揮其在腫瘤診斷和腫瘤治療中可能具有

5、的潛在效用。
　　研究方法:
　　利用酵母雙雜交技術(shù)篩選人肝細(xì)胞cDNA文庫(kù)，獲得可能與MK相互作用的蛋白質(zhì)。然后反向驗(yàn)證和體外蛋白表達(dá)系統(tǒng)驗(yàn)證其和MK的相互作用。最后在人細(xì)胞中采用免疫共沉淀技術(shù)確證MK與篩選出的蛋白質(zhì)間的相互作用關(guān)系。具體步驟如下:a）互相作用蛋白質(zhì)篩選。MK基因克隆入pDBLeu載體，獲得pDBLeu-MK質(zhì)粒，pDBLeu-MK自身激活活性的檢查，從而構(gòu)建成功的bait。pDBLeu-MK與構(gòu)建在pE

6、XP-AD502載體中的cDNA庫(kù)共轉(zhuǎn)染酵母細(xì)胞Mav203，進(jìn)行小量篩庫(kù)和正式篩庫(kù)。將含有pDBLeu-MK與pEXP-cDNA庫(kù)的酵母鋪在適當(dāng)濃度的3-AT的SC-LTH板上，獲得陽(yáng)性克隆后按his活性強(qiáng)弱分開(kāi)點(diǎn)盤(pán)。培養(yǎng)后進(jìn)行X-Gal活性檢測(cè)，得到具有X-Gal活性的陽(yáng)性克隆。抽提陽(yáng)性克隆的質(zhì)粒。質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化入E.coliDH5α細(xì)胞中，通過(guò)氨芐抗性篩選，得到單一的pEXP-候選蛋白質(zhì)質(zhì)粒。b）自身活性鑒定以及活性再鑒定:候選蛋白質(zhì)

7、質(zhì)粒經(jīng)SalⅠ和NcoⅠ限制性?xún)?nèi)切酶進(jìn)行酶切鑒定，并記錄插入片段的大小。將得到的質(zhì)粒與pDBLeu共轉(zhuǎn)入酵母，進(jìn)行自身活性鑒定，并與pDBLeu-MK共轉(zhuǎn)入酵母，進(jìn)行活性再鑒定。c）陽(yáng)性克隆cDNA序列的測(cè)定和BLAST搜索GeneBank的數(shù)據(jù)庫(kù):對(duì)陽(yáng)性克隆進(jìn)行DNA序列分析，然后將所得基因部分序列進(jìn)行同源分析，確定蛋白種類(lèi)，并預(yù)測(cè)其功能。d）MK可能作用蛋白質(zhì)的反向驗(yàn)證:即將MK克隆于pEXP-AD502載體，而將可能作用蛋白質(zhì)的c

8、DNA序列克隆至pDBLeu-X，然后共轉(zhuǎn)染酵母，再次驗(yàn)證它們間的作用關(guān)系。e）體外蛋白表達(dá)系統(tǒng)驗(yàn)證蛋白質(zhì)間的相互作用。將篩選出的與MK相互作用蛋白質(zhì)基因克隆入體外表達(dá)載體pCMVTnT（Promega公司），在TnT體外表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)蛋白質(zhì)。以[35S]蛋氨酸標(biāo)記所表達(dá)的蛋白質(zhì)。采用免疫共沉淀分析和SDS-PAGE電泳及放射自顯影技術(shù)判斷能被MK抗體或者His-tagged MK pull down的蛋白質(zhì)即為MK的相互作用蛋白質(zhì)。f）

9、在人細(xì)胞中確證MK與蛋白質(zhì)間的相互作用關(guān)系。將MK與蛋白質(zhì)分別克隆，共轉(zhuǎn)染人肝癌細(xì)胞HepG2，然后用免疫共沉淀技術(shù)確證兩者在細(xì)胞內(nèi)形成了復(fù)合物。e）以篩選到的顆粒蛋白為代表，先應(yīng)用酵母雙雜交方法和/或突變技術(shù)定位顆粒蛋白前體(Pgrn)與MK作用的結(jié)合位點(diǎn)。然后再應(yīng)用GST蛋白沉降技術(shù)體外驗(yàn)證上述篩選到的Pgrn分子內(nèi)與MK相互作用的結(jié)合位點(diǎn)，根據(jù)結(jié)合位點(diǎn)氨基酸序列設(shè)計(jì)合成競(jìng)爭(zhēng)性抑制小肽。最后再應(yīng)用抑制肽研究MK與Pgrn相互作用在細(xì)

10、胞遷移和血管生成中的作用。
　　研究結(jié)果:
　　利用酵母雙雜交技術(shù)平臺(tái)，并以MK作為誘餌蛋白篩選人肝細(xì)胞cDNA文庫(kù)篩選，篩選到NF-kappa-B inhibitor alpha(I-kappa-B-alpha，IKBA)、Dvl-bindingprotein naked cuticle2(NKD2)、顆粒蛋白(granulin，GRN)、潛活TGF-β結(jié)合蛋白3(LTBP3)、潛活TGF-β結(jié)合蛋白4(LTBP4)、磷脂

11、混雜酶1(PLSCR1)等6種蛋白可與MK相互作用。免疫共沉淀結(jié)果顯示篩選的六種蛋白全都和中期因子直接相互作用。應(yīng)用內(nèi)皮細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)定量分析技術(shù)平臺(tái)、體外管腔生成分析法和血管生成雞胚絨毛尿囊膜(CAM)分析體系發(fā)現(xiàn)并證明了Pgrn與MK的相互作用且該相互作用對(duì)血管生成具有顯著的促進(jìn)作用。完成了MK-Pgrn相互作用的競(jìng)爭(zhēng)性抑制肽的篩選與制備，并證明其有顯著抑制腫瘤血管生成的作用。
　　研究結(jié)論:
　　肝癌細(xì)胞中所篩選到蛋白表