1、針對腎虛濕瘀的病理，治法上我們以益腎清利活血為立法原則，以治病求本、既病防變?yōu)榭傮w原則，一法為主，但又在具體組方時注意調理肺、脾、腎三臟，兼顧濕、熱、瘀三邪，從而達到扶助正氣以固本，祛除病邪以阻止腎纖維化進展，并且兼具預防復發(fā)的作用。 無論腎臟病原發(fā)病因和部位在腎小球、腎小管還是腎血管，最終均可導致腎小管萎縮和消失、腎間質增生和纖維化，腎功能的損害都與腎間質纖維化病變的程度密切相關。這些疾病能引起腎小管上皮細胞的凋亡、腎間質炎性

2、細胞的浸潤、肌成纖維細胞的聚集，并在一些促纖維化因子的參與下，使細胞外基質(ECM)生成增多、降解減少，而產生腎間質纖維化，導致腎功能嚴重受損?？梢娔I間質纖維化與腎病慢性進展密切相關。圍繞小管間質損傷后的間質纖維化發(fā)生發(fā)展及防治方面的研究受到廣泛重視，目前研究認為腎間質纖維化發(fā)生機制可能與多種細胞(如腎小管上皮細胞、間質成纖維細胞等)轉變或轉分化為肌成纖維細胞(MyoFb)，其中TGF-β1可能是主要的致纖維化因子之一，導致小管上皮細胞

3、間充質轉分化(TEMT)和細胞激活。通過臨床經(jīng)驗總結，我們以益腎清利活血法組方，研究其對腎間質纖維化的防治作用。通過以下幾個方面的研究來探討其作用機制。目的：1.闡明整體條件下，以益腎清利活血法組方的中藥對對單側輸尿管梗阻(UUO)大鼠腎間質纖維化的拮抗作用。2.以益腎清利活血為法組方通過中藥含藥血清觀察中藥對人腎小管上皮細胞(HK-2)細胞EMT過程的阻抑作用(以苯那普利作為對照)。方法：1.構建UUO大鼠模型，實驗動物分為假手術組、

4、模型組、益腎清利活血低劑量組、益腎清利活血高劑量組及苯那普利組，在單側輸尿管梗阻術后21天通過免疫組化觀察UUO大鼠腎間質巨噬細胞EDl抗體、NF-кB、α-SMA、PCNA表達；通過逆轉錄聚和酶鏈式反應(RT—PCR)半定量分析TGF—β1、PAI-1、BCL-2 mRNA的表達。2.利用人腎小管近端上皮細胞株(HK-2)，通過中藥含藥血清觀察益腎清利活血復方對HK-2細胞株轉分化過程中間質細胞標志物波形蛋白表達、以及對腎小管上皮細胞

5、轉分化(EMT)發(fā)生的主要信號轉導途徑中Smad4及RhoA mRNA的影響。結果：1.以益腎清利活血為法組方觀察中藥對UUO大鼠腎間質纖維化的拮抗作用(以苯那普利作為對照)。 (1)本實驗結果顯示益腎活血清利方對UUO大鼠腎間質纖維化進程有著顯著的干預作用，從血肌酐、尿素氮的測試結果可看出用藥組大鼠均未進入腎功能不全(P<0.05)。(2)腎小管間質損害程度參照國內唐政分法病理積分顯示用藥各組則顯示對間質纖維化不同程度的抑制作用，與

6、模型組比較差異有顯著性(P<0.01)。(3)實驗結果顯示益腎清利活血方對腎組織羥脯氨酸形成有明顯的抑制作用(P

7、用 (P<0.01)。 (2)研究發(fā)現(xiàn)EDl表達減少的各組NF-κB表達亦輕，中藥各組對NF-κB的積聚與模型組比較有著明顯的抑制作用，但西藥組無顯著作用。 (3)研究顯示用藥各組與模型組比較均可阻抑α-SMA表達，但以益腎清利活血方作用最強(P<0.01)，苯那普利組，中藥高劑量組與模型組比較P<0.05。 (4)實驗證實益腎清利活血方和西藥苯那普利在抑制PCNA的表達方面具有相近的作用(P<0.01)。

8、 3．分析益腎清利活血組方對從致纖維化因子TGF-β1、ECM降解抑制因子PAI-1及凋亡抑制因子BCL-2表達的影響，以明確益腎清利活血治療原則的抗腎間質纖維化的作用機制。 (1)中藥低劑量組對TGF-β1的干預作用最強，與模型組比較有顯著療效(P<0.05)，而中藥高劑量組與西藥組作用弱于中藥低劑量組，無顯著意義。 (2)在UUO大鼠腎組織PAI-1 mRNA的表達結果提示，與模型組比較，中藥低劑量組與苯那普利組

9、均有較好的抑制PAI-1表達的作用(P<0.05)，而中藥高劑量組作用不明顯。 (3)我們實驗觀察中藥低劑量組及中藥高劑量組BCL2 mRNA表達均有顯著的升高(P<0.05)，而苯那普利組則無明顯的作用。 4．以益腎清利活血為法組方通過中藥含藥血清觀察中藥對HK-2細胞(人腎近端小 管上皮細胞)EMT(小管細胞上皮向間質肌成纖維細胞轉分化)過程的阻抑作用(以 苯那普利作為對照)。分析益腎清利活血法組方含藥血清對HK

10、-2細胞EMT過程不 同信號轉導途徑的影響。 (1)波形蛋白的表達以中藥低劑量組最為顯著，其次為中藥高劑量(P<0.05)，苯那普利組作用不明顯。說明它們對HK2細胞的EMT過程的抑制程度是依次減弱的。 (2)HK2細胞EMT過程中Smad4 mRNA的表達，與模型組比較，中藥低劑量組與苯那普利組(P<0.05)均體現(xiàn)出抑制作用，中藥高劑量組作用不明顯。 (3)HK2細胞EMI過程中RhoA mRNA的表達，中

11、藥高劑量組(P<0.05)有抑制其表達的作用，與模型組比較有顯著性意義；中藥低劑量組和苯那普利組無明顯作用。 結論： 1．SD大鼠經(jīng)輸尿管結扎21天后，用藥各組病理變化均較模型組減輕，本實驗結果 顯示益腎清利活血方及洛汀新對UU0大鼠腎間質纖維化進程有著顯著的干預作用，從血肌酐、尿素氮、腎間質病理積分及羥脯氨酸的測試結果可看出用藥組大 鼠均未進入腎功能不全。2．從間質巨噬細胞的浸潤、核轉錄因子的激活、肌成纖維細胞的增

12、多及其增殖活性 的增強，UUO模型就具備了ECM積聚、纖維化形成的前提條件，我們通過免疫組 化從形態(tài)上觀察了UUO大鼠腎間質纖維化過程各個環(huán)節(jié)的變化，在EDl、α-SMA、 PCNA的表達方面中藥組和苯那普利組作用相近；而在NF-κB的表達上則是中藥 低劑量組與中藥高劑量組優(yōu)于苯那普利組。 3．我們選擇致纖維化因子TGF-β1、ECM降解抑制因子PAI-1及凋亡抑制因子BCL2 作為觀察指標，通過RT-PCR的半定量分

13、析各治療組對UUO大鼠整體纖維化的調 控因子，與模型組相比，中藥低劑量組療效優(yōu)于中藥高劑量組及苯那普利組，并 且在抑制凋亡的方面作用是獨特而顯著的。 4．在探討中藥對腎小管上皮細胞(HK2)發(fā)生轉分化過程的多信號途徑干預作用的研 究中，發(fā)現(xiàn)用藥各組均有抑制HK2細胞EMT、環(huán)節(jié)的作用，在波形蛋白及Smad4的 表達上中藥低劑量組均顯示出抑制作用，苯那普利在Smad4的表達上有一定抑制 作用，在波形蛋白及RhoA的表達上