1、背景：
　　誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞(iPSC)是通過(guò)對(duì)體細(xì)胞重編程得到的多能干細(xì)胞,具有與胚胎干細(xì)胞類(lèi)似的自我更新和多向分化潛能。Taka has hi等采用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體分別向鼠和人的成纖維細(xì)胞導(dǎo)入特定的轉(zhuǎn)錄因子,首次成功建立了 miPSC和hiPSC。因其具有取材容易,避免了胚胎干細(xì)胞的倫理問(wèn)題,同體移植免疫排斥反應(yīng)弱等諸多優(yōu)點(diǎn)逐漸成為心臟再生治療中備受注目的細(xì)胞來(lái)源。然而,由于iPSC具有較高的惡性增殖能力、心肌誘導(dǎo)分化效率低,如

2、何降低其成瘤性以及提高分化效率成為亟待解決的重要問(wèn)題。Ape lin是一種調(diào)節(jié)心血管系統(tǒng)功能的活性肽,高表達(dá)于小鼠胚胎心臟發(fā)生原始部位,已被證實(shí)對(duì)胚胎干細(xì)胞的心肌定向分化具有促進(jìn)作用。
　　目的：
　　本實(shí)驗(yàn)采用apelin對(duì)人誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞(hiPSC)進(jìn)行誘導(dǎo),探討其對(duì)心肌細(xì)胞定向分化的作用。
　　方法：
　　(1)利用小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(MEF)制備hiPSC滋養(yǎng)層細(xì)胞;
　　(2) hiPSC的培

3、養(yǎng)與傳代;
　　(3)免疫熒光染色(IF)鑒定hiPSC干細(xì)胞全能性標(biāo)志物Oct4和Nanog;
　　(4)利用懸浮法制備擬胚體（EB),對(duì)照組使用常規(guī)誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基,處理組在培養(yǎng)液中加入apelin;
　　(5) qPCR檢測(cè)不同誘導(dǎo)時(shí)間點(diǎn)擬胚體干細(xì)胞全能性標(biāo)志物和心臟發(fā)生過(guò)程中階段性標(biāo)志物基因表達(dá)水平;
　　(6) Western blot檢測(cè)不同誘導(dǎo)時(shí)間擬胚體干細(xì)胞全能性標(biāo)志物和心臟發(fā)生過(guò)程中階段性標(biāo)志物的

4、蛋白表達(dá)水平;
　　(7) IF檢測(cè)對(duì)照組與apelin處理組間縫隙連接蛋白43(Cx43)和心肌特異性分化標(biāo)志物肌鈣蛋白I(cTn I)的表達(dá)變化差異及流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測(cè)兩組cTn I的陽(yáng)性率;
　　(8)透射電鏡(TEM)觀察對(duì)照組與apelin處理組心肌樣細(xì)胞(hiPSC-CM)的超微結(jié)構(gòu)變化。
　　結(jié)果：
　　(1) hiPSC在倒置顯微鏡下觀察呈類(lèi)圓形克隆,在滋養(yǎng)層細(xì)胞背景下邊界清晰且立體感強(qiáng)。全

5、能性干細(xì)胞標(biāo)志物Oct-4、Nanog免疫熒光染色后呈陽(yáng)性;經(jīng)懸浮培養(yǎng)后形成擬胚體,隨誘導(dǎo)時(shí)間逐漸向周邊分化。
　　(2) qPCR的結(jié)果顯示,apelin處理組中干細(xì)胞全能性標(biāo)志物Oct4和Nanog在誘導(dǎo)分化后第3天的表達(dá)水平下降,為同期對(duì)照組的(63.2±10.1)％和(51.7±1.6)%(p<0.01); Nkx2.5和CTn I在分化后第7天表達(dá)上調(diào),分別為同期對(duì)照組的(162.4±22.5)%和(250.6±22.3

6、)%(p<0.05,p<0.01)說(shuō)明ape lin可促進(jìn)擬胚體向心臟譜系細(xì)胞分化,提高擬胚體心臟發(fā)生過(guò)程中階段性特異性標(biāo)志物基因表達(dá)的水平;
　　(3) Western blot檢測(cè)顯示,apelin處理組在Nanog的表達(dá)隨apelin處理天數(shù)的延長(zhǎng)而逐漸降低,于第15天下降最為明顯,Mef2c、c Tn T在第7天表達(dá)增強(qiáng),第15天cTn I表達(dá)明顯增加;
　　(4) IF檢測(cè)結(jié)果顯示,兩組均有Cx43、cTn I表達(dá)

7、,但apelin處理組的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量明顯增多。
　　(5) FCM鑒定結(jié)果顯示,對(duì)照組與 apelin處理組 cTn I的陽(yáng)性率分別為(9.3±5.2)%和(52.2±6.7)%,有顯著性差異(p<0.05);
　　(6) TEM結(jié)果顯示,對(duì)照組胞內(nèi)有線粒體的出現(xiàn),但內(nèi)外膜不清晰;ape lin處理組出現(xiàn)排列規(guī)則的肌纖維,胞內(nèi)出現(xiàn)成熟的線粒體。
　　結(jié)論：
　　Ape lin可促進(jìn)hiPSC分化產(chǎn)物的心肌分化標(biāo)志