1、體細胞誘導(dǎo)為多能干細胞(induced pluripotent stem cells，iPSCs)技術(shù)的出現(xiàn)引起了全球廣泛的關(guān)注，其在體細胞重編程機理和再生醫(yī)學(xué)應(yīng)用等方面的研究中具有不可比擬的價值和優(yōu)越性，并且避免了因使用胚胎干細胞而涉及到的倫理問題。牛作為大家畜中的最重要物種，為人類提供了絕大多數(shù)的肉和奶制品，對其體細胞誘導(dǎo)為多能干細胞原理和技術(shù)進行深入研究顯得尤其重要。本研究對牛誘導(dǎo)多能干細胞(biPSCs)的制備方法和原理、生物學(xué)

2、特性等進行系統(tǒng)的探討，以期推動其他大家畜誘導(dǎo)多能性的研究。
　　 1.建立了無病毒介導(dǎo)生產(chǎn)牛誘導(dǎo)多能干細胞的方法。
　　 研究結(jié)果顯示，本研究成功構(gòu)建兩個包含不同轉(zhuǎn)錄因子順序的質(zhì)粒載體pOSKM和pKMOS，并使用脂質(zhì)體法和電穿孔法介導(dǎo)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染兩種方法將所構(gòu)建質(zhì)粒載體成功轉(zhuǎn)染牛成纖維細胞，細胞質(zhì)粒轉(zhuǎn)染12天后檢測到4轉(zhuǎn)錄因子內(nèi)源性表達；2i/LIF培養(yǎng)液對成纖維細胞早期重編程有重要作用，PD有效的抑制牛成纖維細胞MEK1

3、/2信號通路，CHIR顯著增加牛成纖維細胞的堿性磷酸酶(AP)活性；兩種方法轉(zhuǎn)染后細胞在2i/LIF培養(yǎng)液中培養(yǎng)均可形成類iPS克隆。
　　 2.優(yōu)化和完善了牛多能干細胞誘導(dǎo)和培養(yǎng)體系。
　　 研究結(jié)果顯示，兩個不同轉(zhuǎn)錄因子順序的質(zhì)粒(pOSKM和pKMOS)對biPSCs的生產(chǎn)沒有顯著影響；脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法無論從單細胞Sox2陽性率還是從類iPS克隆形成率都顯著高于電轉(zhuǎn)染法(15.8% vs2.1%；63.7 vs23.4

4、，p<0.05)；胚胎和胎兒來源的細胞其轉(zhuǎn)染效率顯著高于成體細胞，而轉(zhuǎn)基因的胎兒細胞與成體細胞在轉(zhuǎn)染效率方面無顯著差異。在類iPS克隆形成率方面，胎兒成纖維細胞系BFF64(♂)顯著低于胚胎成纖維細胞系，但顯著高于其他所有細胞系，成年體細胞系與轉(zhuǎn)基因胎兒細胞系差異不顯著，胎兒成纖維細胞系最優(yōu)；玻璃材質(zhì)上培養(yǎng)的轉(zhuǎn)染后細胞無論是克隆形成時間和AP陽性克隆形成率都顯著優(yōu)于塑料材質(zhì)，8孔培養(yǎng)玻片出現(xiàn)克隆的時間最早，10 mm細胞爬片形成AP陽性

5、克隆數(shù)量最多；轉(zhuǎn)染細胞培養(yǎng)于飼養(yǎng)層或?qū)诱尺B蛋白處理的培養(yǎng)皿中，AP陽性克隆形成率顯著高于其他組，而二者之間無顯著差別；低氧培養(yǎng)體系(5%O2)培養(yǎng)轉(zhuǎn)染后細胞，與正常20%O2培養(yǎng)體系比較，發(fā)現(xiàn)對biPSCs的生產(chǎn)沒有顯著影響。
　　 3.初步弄清了牛誘導(dǎo)多能干細胞的生物學(xué)特性。
　　 研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，biPSCs集落性生長形成克隆，克隆隆起呈島狀，細胞亮度高，邊緣整齊光滑折光性強，細胞排列致密，無明顯細胞間隔，與牛類胚胎干

6、細胞克隆、小鼠ES/iPS克隆相似且為AP染色陽性；RT-PCR結(jié)果表明biPSCs表達多能性標(biāo)志基因OCT4、SOX2、KLF4、C-MYC、CDH1、NANOG、DPPA3、SALLA、SOCS3和ZFP42，且表達STAT3，但不表達外胚層干細胞特異性基因T-BRACHYURY、FGF5和LEFTY2；免疫組化染色結(jié)果顯示biPSCs表達表面抗原TRA-1-60、TRA-1-81、SSEA-3和SSEA-4，但不表達SSEA-1，

7、并表達SOX2和OCT4蛋白；biPSCs具有端粒酶活性和正常染色體核型(60條)；biPSCs體外延時培養(yǎng)可以自發(fā)分化成類上皮細胞、類神經(jīng)細胞和類脂肪細胞等多種類型的細胞，體外懸浮培養(yǎng)可形成擬胚體，并能在體內(nèi)分化形成畸胎瘤。
　　 4.對牛誘導(dǎo)多能干細胞外源轉(zhuǎn)錄因子的表達模式及增值與凋亡性能進行了研究。
　　 研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染后初期細胞重編程主要依靠轉(zhuǎn)錄因子外源表達來推動，18天后biPSCs多能性的維持主要依靠轉(zhuǎn)錄

8、因子的內(nèi)源表達；EdU標(biāo)記細胞增殖檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染后細胞在2i/LIF培養(yǎng)液中培養(yǎng)的過程中增殖率迅速下降，克隆形成前細胞遷移頻繁，細胞在重編程過程中的遷移對類iPS克隆形成非常重要。增殖特異性標(biāo)記蛋白Ki67和標(biāo)志性抗原PCNA免疫組化染色獲得了相似的結(jié)果；細胞凋亡檢測發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染后16天牛類iPS克隆，僅有1±0.4%細胞發(fā)生凋亡，而這一階段細胞增殖率為1±0.5%，因此98±0.9%細胞處于細胞沉默狀態(tài)；類iPS克隆傳代后有較高的再貼

9、壁率，但2i/LIF培養(yǎng)液不支持傳代后牛類iPS克隆的增殖。
　　 結(jié)論：本研究構(gòu)建了兩個包含不同轉(zhuǎn)錄因子順序的外源質(zhì)粒，成功的使用脂質(zhì)體和電穿孔法對牛成纖維細胞進行轉(zhuǎn)染，并在2i/LIF培養(yǎng)液培養(yǎng)條件下成功制作biPSCs；對影響biPSCs生產(chǎn)效率的多個因素進行探討，其中脂質(zhì)體法優(yōu)于電穿孔法、牛胚胎成纖維細胞優(yōu)于其他種類細胞、玻璃材質(zhì)培養(yǎng)容器優(yōu)于塑料材質(zhì)、飼養(yǎng)層和層粘連蛋白(LN)預(yù)處理優(yōu)于其他預(yù)處理；實驗所得biPSCs具