1、肝細(xì)胞癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)是世界上最常見、惡性程度最高的腫瘤之一，其病死率在全球所有癌癥中占第3位，在國內(nèi)居第2位。手術(shù)切除仍是目前肝癌獲得長期生存的主要手段，但即使是小肝癌根治性切除，5年內(nèi)仍有60-70％的病人出現(xiàn)轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)，因此探索肝癌轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)的機(jī)制，尋找有效的抑制途徑，探索肝癌術(shù)后預(yù)測因子，準(zhǔn)確區(qū)分患者，特別是發(fā)現(xiàn)早期肝癌的預(yù)后因子已成為進(jìn)一步提高肝癌生存率的關(guān)鍵。
　　以往大量研究

2、證實(shí)，免疫微環(huán)境中Th1、Th2及Th17類細(xì)胞因子的動態(tài)變化在多種人類惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中起重要作用。此前我們與美國國立衛(wèi)生研究院(NIH)的合作研究構(gòu)建了包含17個(gè)免疫細(xì)胞因子的預(yù)測模型預(yù)測腫瘤復(fù)發(fā)。本課題組在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步采用微流體低密度表達(dá)芯片技術(shù)(qRT-PCR)對以上預(yù)測模型優(yōu)化后發(fā)現(xiàn)癌旁IL-2、IL-15基因表達(dá)可以作為早期肝癌術(shù)后預(yù)后的獨(dú)立預(yù)測因子。以上是基于基因轉(zhuǎn)錄水平的研究。周海軍等還發(fā)現(xiàn)在肝細(xì)胞癌患者中，癌

3、周肝組織的高IL-2和IL-15水平與肝內(nèi)腫瘤復(fù)發(fā)率的降低和整體生存時(shí)間的延長顯著相關(guān)，但在癌組織中未發(fā)現(xiàn)相關(guān)趨勢，說明免疫微環(huán)境對腫瘤進(jìn)展的作用可能發(fā)生在癌周微環(huán)境中。然而細(xì)胞因子IL-2、IL-15在蛋白水平是否能夠影響腫瘤自身生物學(xué)特性及其造成影響的相關(guān)調(diào)節(jié)機(jī)制尚不明確。
　　另外，我們的前期研究發(fā)現(xiàn)調(diào)控肝癌轉(zhuǎn)移潛能的基因改變在其原發(fā)瘤階段即已存在，此為轉(zhuǎn)移理論的重要進(jìn)展。研究還發(fā)現(xiàn)骨橋蛋白(Osteopontin，OPN)

4、表達(dá)升高與肝癌遷徙轉(zhuǎn)移能力密切相關(guān)。有文獻(xiàn)報(bào)道OPN可在不同水平調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)，它可以起類似促炎因子的作用，能夠通過增強(qiáng)Th1類細(xì)胞因子的表達(dá)而調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)，但是有研究認(rèn)為OPN對炎癥具有雙向調(diào)節(jié)作用，既有促炎效應(yīng)又有抗炎效應(yīng)。其不同的亞型或剪接體、不同表達(dá)水平、表達(dá)時(shí)相和不同的組織分布其功能都可能會有所不同。為此，本研究我們在前期研究結(jié)果的基礎(chǔ)上首先通過免疫組化及ELISA方法在一組包含78例癌旁樣本的病例中驗(yàn)證IL-2、IL-15的預(yù)

5、測預(yù)后價(jià)值，發(fā)現(xiàn)IL-2、IL-15與肝癌復(fù)發(fā)相關(guān)，并進(jìn)一步在體內(nèi)加以驗(yàn)證及探尋其相關(guān)調(diào)節(jié)機(jī)制。
　　第一部分IL-2和IL-15對肝細(xì)胞癌生長轉(zhuǎn)移的影響
　　目的:前期研究發(fā)現(xiàn)，癌旁免疫炎癥相關(guān)的細(xì)胞因子IL-2、IL-15 mRNA與肝癌的預(yù)后密切有關(guān)，本研究的目的是在細(xì)胞因子蛋白水平上進(jìn)一步進(jìn)行人癌周肝組織水平驗(yàn)證，同時(shí)結(jié)合評價(jià)IL-2、IL-15干預(yù)對DEN誘導(dǎo)的大鼠肝細(xì)胞癌模型自身特征的改變，通過人體標(biāo)本和動物實(shí)驗(yàn)

6、探討IL-2、IL-15對肝細(xì)胞癌生長轉(zhuǎn)移的影響。
　　方法:應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色、ELISA方法分析78例肝細(xì)胞癌癌旁肝組織，通過統(tǒng)計(jì)學(xué)方法評價(jià)癌旁微環(huán)境中IL-2、IL-15的表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系。IL-2、IL-15干預(yù)DEN誘導(dǎo)大鼠肝細(xì)胞癌模型，觀察不同時(shí)期腫瘤數(shù)目、肝重、肺轉(zhuǎn)移灶以及生存狀況相關(guān)特征變化。
　　結(jié)果:78例患者復(fù)發(fā)組和無復(fù)發(fā)組與BCLC分期(P=0.02)有關(guān)，與鏡下癌栓(P＜0.0001)顯著相關(guān)

7、。應(yīng)用Cox回歸模型評估一般臨床病理因素對術(shù)后復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)比發(fā)現(xiàn):單因素分析中腫瘤大小(P=0.036，HR=0.280，95％CI=0.085-0.922);鏡下癌栓（P=0.011，HR=2.617，95％CI=1.247-5.494）與復(fù)發(fā)相關(guān)。而多因素分析發(fā)現(xiàn)兩者均是影響復(fù)發(fā)的獨(dú)立因子。組化染色水平上，IL-2、IL-15表達(dá)與臨床病理特征無明確相關(guān)性。IL-2對早期肝癌術(shù)后生存復(fù)發(fā)均有良好的預(yù)測效能，癌旁IL-2是預(yù)測肝癌復(fù)發(fā)及

8、生存的獨(dú)立因素。而IL-15對總體生存(OS)及復(fù)發(fā)影響均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。ELISA檢測蛋白濃度水平上，腫瘤分化程度與IL-15濃度水平相關(guān)(P=0.016)。用中位數(shù)作為分界點(diǎn)時(shí)，IL-2、IL-15蛋白濃度水平高低均是影響患者術(shù)后生存復(fù)發(fā)的獨(dú)立因子。采用Kaplan-Meier法分析發(fā)現(xiàn)IL-2(P＜0.0001)，IL-15(P=0.004)蛋白濃度與TTR顯著相關(guān)。同樣兩者對OS均有顯著預(yù)測效能，低表達(dá)的病例預(yù)后顯著差于高表達(dá)的病

9、例(P＜0.0001)。ROC曲線進(jìn)一步驗(yàn)證了78例早期肝癌患者IL-2(AUC=0.756)、IL-15(AUC=0.691)預(yù)測復(fù)發(fā)的效能。體內(nèi)試驗(yàn)中，實(shí)驗(yàn)組100只大鼠，至第16周，死亡11只(11/100)，建模成功率為89.0％。另外實(shí)驗(yàn)組大鼠體重為302.7±20.2g，而同期正常喂養(yǎng)對照組大鼠體重為408.4±9.9g，兩者有明顯差異(P＜0.05)。給予IL-2、IL-15(20000U/ml)干預(yù)大鼠后， IL-2干預(yù)

10、組、IL-15干預(yù)組大鼠體重較生理鹽水模型對照組有明顯差異(292.7±20.4g，290.4±18.8g vs274.7±12.5g，Mann-Whitney test，p＜0.01)，第22周，IL-2干預(yù)組、IL-15干預(yù)組大鼠存活率較同期鹽水對照組有差異[44.4％(4/9)，25％(2/8)vs0，logrank P=0.02]，而兩干預(yù)組間無差異(logrankP=0.11)。第20周，我們發(fā)現(xiàn)IL-2干預(yù)組、IL-15干預(yù)

11、組較鹽水對照組死亡大鼠肝臟表面結(jié)節(jié)數(shù)目[21.5±0.7，23.0±1.4 vs28.0±1.4，(P＜0.05)]、肝重比(32.0±0.9％，33.2±0.4％ vs38.2±0.9％，P＜0.05)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，且IL-2干預(yù)效果更佳。第17周首次觀測到受測鹽水對照組大鼠(2/7)出現(xiàn)肺轉(zhuǎn)移，第19周，IL-2干預(yù)組、IL-15干預(yù)組較對照組肺轉(zhuǎn)移發(fā)生率為[50％(2/4)，25％(1/4) vs100％(8/8)]，肺轉(zhuǎn)移發(fā)生率

12、及累積程度有明顯差異(P＜0.05)。IL-2、IL-15改善肝癌大鼠模型生存及抑制肺轉(zhuǎn)移。
　　結(jié)論: IL-2和IL-15細(xì)胞因子蛋白表達(dá)影響早期肝細(xì)胞癌患者術(shù)后生存復(fù)發(fā)，可以作為早期肝癌術(shù)后預(yù)后的獨(dú)立預(yù)測因子，IL-2預(yù)測效能優(yōu)于IL-15。IL-2和IL-15具有相似功能，均能抑制腫瘤生長及肺轉(zhuǎn)移，從而改善肝癌大鼠模型生存。
　　第二部分IL-2和IL-15抑制肝細(xì)胞癌生長轉(zhuǎn)移的相關(guān)調(diào)節(jié)機(jī)制
　　目的:我們前面

13、的研究發(fā)現(xiàn)IL-2、IL-15是預(yù)測復(fù)發(fā)及總體生存的獨(dú)立預(yù)測因子。惡性腫瘤的Th1/Th2免疫平衡狀態(tài)及其與腫瘤的生物學(xué)行為及預(yù)后的關(guān)系正日益受到了國內(nèi)外廣大學(xué)者的重視。IL-2和IL-15是Th1類細(xì)胞因子，能誘導(dǎo)、增強(qiáng)細(xì)胞免疫而殺傷腫瘤細(xì)胞。本研究擬動態(tài)分析DEN誘導(dǎo)的大鼠肝細(xì)胞癌模型建模過程中Th1/Th2免疫狀態(tài)變化及外源性重組蛋白IL-2、IL-15對模型腫瘤微環(huán)境的影響和調(diào)節(jié)機(jī)制，為腫瘤治療提供新理論和新靶點(diǎn)。
　　方

14、法:我們通過Procarta細(xì)胞因子熒光微珠檢測試劑盒檢測不同時(shí)間點(diǎn)大鼠模型標(biāo)本血清和肝組織中相關(guān)細(xì)胞因子濃度，分析Th1、Th2及Th17類細(xì)胞因子的表達(dá)特征。后應(yīng)用RT-PCR技術(shù)探尋T-bet、GATA-3、FOXP3以及ROR-γt等與免疫相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子mRNA表達(dá)水平。Western blot進(jìn)一步明確癌旁組織相關(guān)蛋白表達(dá)趨勢，探討TGF-β、OPN變化特征，評價(jià)IL-2、IL-15對腫瘤免疫微環(huán)境的影響。
　　結(jié)果:應(yīng)用

15、Procarta細(xì)胞因子檢測試劑盒檢測各時(shí)間點(diǎn)（1，4，8，12，16，17，18，19周）血清及癌旁肝組織IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-12p40、IL-17、IFN-γ和TGF-β濃度，發(fā)現(xiàn)在建模早期（≤8周），Th1型細(xì)胞活化，免疫狀態(tài)向Th-1偏移，其后（＞8周）Th1型細(xì)胞因子IL-12p40、IFN-γ、 IL-2逐漸降低。而Th2型細(xì)胞因子IL-4、IL-10持續(xù)升高，伴隨IL-17及炎癥抑制因子TGF-

16、β明顯升高，使機(jī)體細(xì)胞免疫持續(xù)抑制。而IL-2、IL-15干預(yù)后可以逆轉(zhuǎn)這種現(xiàn)象，Th1型細(xì)胞因子濃度升高，Th2型細(xì)胞因子濃度逐漸下降。另外炎癥抑制因子TGF-β、IL-17濃度下調(diào)，在第19周，IL-2、IL-15干預(yù)兩組較之鹽水對照組有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)，但兩者未見明顯差異(P＞0.05)。提示IL-2、IL-15可以下調(diào)炎癥抑制因子TGF-β改變肝細(xì)胞癌大鼠模型免疫狀態(tài)而使微環(huán)境向Th1偏移，促進(jìn)特異性免疫殺傷腫瘤細(xì)

17、胞。進(jìn)一步在轉(zhuǎn)錄水平上驗(yàn)證，成瘤過程中，發(fā)現(xiàn)Th1型轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子T-bet△Ct先降低，后再升高，表明早期有炎癥過程，而后表現(xiàn)為炎癥抑制，而Treg以及Th2型相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子FOXP3、GATA3△Ct持續(xù)降低，表現(xiàn)為微環(huán)境炎癥抑制，微環(huán)境由Th1向Th2偏移。同時(shí)，Th17細(xì)胞類型調(diào)控因子ROR-γt在12周前先有下降而后出現(xiàn)反轉(zhuǎn)，微環(huán)境表現(xiàn)為炎癥抑制狀態(tài)，促進(jìn)腫瘤發(fā)生。另外， OPN mRNA含量持續(xù)升高，進(jìn)一步表明在成瘤過程中OPN

18、起著促癌作用。IL-2、IL-15干預(yù)后，發(fā)現(xiàn)大鼠免疫微環(huán)境重新向Th1偏移，Treg減少，OPN mRNA含量也出現(xiàn)下降趨勢。最后用Western blot檢測TGF-β和OPN及相關(guān)蛋白變化，發(fā)現(xiàn)模型成瘤過程中TGF-β和OPN濃度逐漸升高，OPN下游的轉(zhuǎn)移相關(guān)因子UPA/MMP-3/MMP-9早期均無明顯變化趨勢，進(jìn)展期表達(dá)逐漸升高，促進(jìn)腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移。P53/RYBP持續(xù)下調(diào)，BCL-2逐漸上升，機(jī)體表現(xiàn)為凋亡抑制，加速腫瘤發(fā)展。

19、膜表面Wnt受體LRP6表達(dá)緩慢上調(diào)，激活Wnt通路，從而提升胞漿中β-catenin的濃度，進(jìn)而激活原癌基因C-MYC磷酸化而促進(jìn)。IL-2及IL-15干預(yù)后均反轉(zhuǎn)而表現(xiàn)為TGF-β、OPN UPA、MMP-3和MMP-9的表達(dá)下調(diào)，抑制Wnt通路活化，減少效應(yīng)靶基因C-myc磷酸化，從而調(diào)控OPN的表達(dá)改善DEN誘導(dǎo)肝癌模型生存。同時(shí)IL-2能上調(diào)P53/RYBP表達(dá)，下調(diào)BCL-2，促進(jìn)凋亡。
　　結(jié)論:DEN誘導(dǎo)大鼠肝細(xì)胞

20、模型成瘤過程中微環(huán)境向Th2偏移，同時(shí)Treg和Th17細(xì)胞增多，炎癥抑制，Wnt通路激活，上調(diào)癌基因C-MYC表達(dá)，繼而正向調(diào)控OPN，促進(jìn)腫瘤發(fā)生發(fā)展。外源性IL-2和IL-15能下調(diào)TGF-β促使微環(huán)境Th1/Th2平衡向Th1偏移，同時(shí)減少Treg細(xì)胞和Th17細(xì)胞的分化，解除炎癥抑制。IL-2能通過P53/C-MYB/RYBP/BCL-2調(diào)控凋亡。IL-2和IL-15還可經(jīng)下調(diào)TGF-β途徑來調(diào)控OPN表達(dá)，通過下調(diào)LRP6以

21、及β-catenin來抑制Wnt通路，從而下調(diào)靶基因C-MYC激活繼而抑制OPN表達(dá)，下調(diào)GATA-3改造微環(huán)境抑制腫瘤進(jìn)展。
　　創(chuàng)新點(diǎn):
　　1.我們首次應(yīng)用外源性重組IL-2和IL-15蛋白干預(yù)DEN誘導(dǎo)的大鼠肝細(xì)胞癌模型進(jìn)行體內(nèi)試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)IL-2和IL-15能下調(diào)TGF-β及下調(diào)LRP6、β-catenin抑制Wnt通路活化促使Th1/Th2平衡向Th1偏移，同時(shí)減少Treg細(xì)胞和Th17細(xì)胞，解除炎癥抑制，最終改善

22、生存。
　　2.體內(nèi)試驗(yàn)首次發(fā)現(xiàn)外源性IL-2和IL-15可下調(diào)TGF-β來調(diào)控OPN表達(dá);還可抑制Wnt通路，從而下調(diào)靶基因C-MYC激活繼而抑制OPN表達(dá)，IL2能通過P53/C-MYB/RYBP/BCL2調(diào)控凋亡。最終調(diào)節(jié)腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移能力改善模型生存。
　　3.本研究同時(shí)從癌旁微環(huán)境和腫瘤自身著手，探尋免疫微環(huán)境和腫瘤之間的互動機(jī)制，尋找腫瘤新的干預(yù)手段。
　　潛在應(yīng)有價(jià)值
　　1.癌旁IL-2和IL-15