1、腫瘤浸潤淋巴細胞(tumor-infiltrating lymphocyte,TIL)是脫離血流后遷移至腫瘤組織的白細胞,主要由T細胞、B細胞和NK細胞組成。TIL對黑素瘤的過繼治療取得了很好的效果,而對肝癌的療效并不理想,這可能與肝癌內(nèi)TIL相對少見以及調(diào)節(jié)性T細胞的免疫抑制有關(guān)。TIL的分離和擴增方法以及快速擴增(rapid expansion procedure,REP)所需的大量IL-2和飼養(yǎng)細胞限制了這種過繼治療在世界范圍內(nèi)的

2、推廣。
　　 IL-15具有刺激T細胞增殖,調(diào)節(jié)B細胞增殖和分化,提高NK細胞的殺傷活性并維持其存活,誘導細胞毒性T細胞的產(chǎn)生和殺傷活性,抑制活化T細胞的凋亡等功能。另外,IL-15可通過活化磷脂酰肌醇-3-激酶途徑使淋巴細胞能抵抗調(diào)節(jié)性T細胞的抑制作用。
　　 本研究利用攜帶IL-15基因的嵌合型腺病毒-腺相關(guān)病毒雜合載體Ad5/35.AAV-hIL-15轉(zhuǎn)染TIL表達IL-15。5/35嵌合型腺病毒可以有效轉(zhuǎn)染T細胞

3、和NK細胞,AAV反向末端重復序列(inverted terminal repeat,ITR)的引入可以使目的基因在細胞內(nèi)持續(xù)穩(wěn)定表達,突變胸苷激酶(thymidine kinase,TK)基因的表達可以使細胞在加入丙氧烏苷(gancyclovir,GCV)后發(fā)揮自殺功能。
　　 本研究用組織塊培養(yǎng)獲得了“年輕”TIL,并對TIL REP中抗CD3單克隆抗體(OKT3)、IL-2及飼養(yǎng)細胞的用量進行了試驗性摸索,發(fā)現(xiàn)OKT3用量

4、增加并不會顯著提高TIL的擴增倍數(shù),而采用3000 IU/ml IL-2或50倍于TIL的飼養(yǎng)細胞的擴增倍數(shù)分別與6000 IU/ml和200倍的相當。最終,選擇30 ng/ml OKT3、3000 IU/ml IL-2和50倍的飼養(yǎng)細胞進行TIL,REP,擴增達4000倍以上。若用于REP的TIL細胞數(shù)不少于5×107,那么理論上擴增后TIL可達到2×1011以上。
　　 對含尼IL-15基因的質(zhì)粒進行PCR,得到的目的基因產(chǎn)

5、物與質(zhì)粒pDC759-TV1經(jīng)EcoRI和BamHI酶切后連接,成功構(gòu)建了質(zhì)粒pDC759-hIL-15。質(zhì)粒鑒定正確后與含35型腺病毒纖毛的腺病毒骨架質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293細胞,同源重組產(chǎn)生雜合病毒Ad5/35.AAV-hIL-15。該病毒充分結(jié)合了腺病毒和AAV的優(yōu)勢,能有效轉(zhuǎn)染T細胞并穩(wěn)定表達IL-15。
　　 采用CopGFP報告基因證實了載體Ad5/35.AAV對TIL的轉(zhuǎn)染效率明顯高于Ad5.AAV。ELISA檢測到病毒A

6、d5/35.AAV-hIL-15轉(zhuǎn)染的TIL有目的蛋白IL-15的表達。MOI=1、10時病毒Ad5/35.AAV-hIL-15可促進TIL增殖,MOI=100時則對增殖不利。加入GCV后,觀察病毒Ad5/35.AAV-TK-CopGFP轉(zhuǎn)染的SMMC-7721的綠色熒光及細胞形態(tài),MTT法檢測病毒轉(zhuǎn)染后TIL的增殖情況,最終確認了病毒轉(zhuǎn)染后突變TK的表達及其自殺功能。MOI=1、10時病毒Ad5/35.AAV-hIL-15轉(zhuǎn)染的。TI