1、BRD7是本室自主克隆的一個鼻咽癌候選抑瘤基因,具有阻止細胞周期G1-S期進程、始動細胞凋亡、逆轉(zhuǎn)細胞惡性生物學行為的特征。該基因能結(jié)合和識別乙?；M蛋白H3,是Bromodomain家族成員之一。BRD7通過參與ras/MEK/ERK、Rb/E2F和Wnt等多條信號通路實現(xiàn)抑瘤功能,是一個在鼻咽癌發(fā)病過程中與細胞周期和凋亡密切相關的核轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子。盡管BRD7基因抑瘤功能和作用機制研究已經(jīng)取得了突破性的進展,但仍然缺乏強有力的體內(nèi)實驗

2、依據(jù)。
　　新近發(fā)展的基因敲除技術是利用同源重組原理使特定的靶基因失活進而實現(xiàn)在其功能缺失的情況下分析靶基因功能的方法。通過基因剔除,可以從整體和細胞水平上反映基因剔除后一系列表型的改變。為此,本課題以C57BL/6小鼠為研究模型,一方面系統(tǒng)比較鼠源性BRD7與人BRD7基因在mRNA序列和氨基酸序列上的同源性,并研究其在小鼠全身各組織中的表達規(guī)律；另一方面利用Cre/LoxP系統(tǒng),探索基因剔除小鼠模型構(gòu)建和鑒定的方法,構(gòu)建BRD

3、7條件性剔除小鼠模型,為體內(nèi)研究BRD7的抑瘤功能、全面考察BRD7參與正常生理、疾病發(fā)生的功能和機制奠定堅實基礎。具體實驗結(jié)果如下：
　　一.鼠源性BRD7的序列特征和表達
　　1.鼠源性BRD7的序列特征
　　C57BL是小鼠的一個品系,是一種常見的基因剔除研究動物模型。C57BL小鼠BRD7(mBRD7)的編碼框序列為1956bp,含17個外顯子,編碼651個氨基酸。人BRD7(hBRD7)的編碼框序列同為195

4、6bp,含13個外顯子,亦編碼651個氨基酸。mBRD7的mRNA和氨基酸序列與hBRD7的同源性均高達88％,說明C57BL小鼠中BRD7發(fā)揮的功能與人體組織中BRD7發(fā)揮的功能類似,是BRD7基因剔除小鼠構(gòu)建的最佳小鼠品系。
　　2.mBRD7在小鼠全身各組織中的表達規(guī)律研究
　　通過數(shù)字化表達分析(電子雜交),mBRD7在腦、眼睛、心臟、肝、肺、胰腺、皮膚、睪丸、腸、血液、骨和前列腺等表達水平較高,在肌肉、唾液腺、胃等

5、組織中表達較低,是一個存在廣泛表達的保守基因。進一步通過熒光定量PCR檢測,發(fā)現(xiàn)mBRD7的平均CT值為24.2個循環(huán),GAPDH的平均CT值為19.0個循環(huán),其mRNA表達水平是GAPDH的1/36.76。BRD7在小鼠全身各組織中整體表達處于中低度水平,呈泛表達,但在睪丸、附睪、精囊腺、生精管等雄性生殖相關的組織以及脾、肺、外耳等組織中表達較高,推測BRD7可能與小鼠雄性生育存在某種關聯(lián)。
　　二.BRD7基因剔除小鼠模型的構(gòu)

6、建
　　1.BRD7LoxP1-2+/-小鼠的構(gòu)建和鑒定
　　LoxP插入的雜合子小鼠(Flox小鼠)是條件性基因剔除小鼠過程中的重要步驟,系與上海南方模式生物研究中心合作完成。整個制備過程包括條件性打靶載體的構(gòu)建、胚胎干細胞的基因打靶、陽性ES細胞克隆的篩選、重組ES細胞囊胚腔注射、嵌合體小鼠的獲得等,通過毛色和基因型鑒定獲得LoxP插入的雜合子小鼠(BRD7.LoxP1-2+/-小鼠)。在獲得BRD7LoxP1-2+/-

7、小鼠的基礎上,抽提小鼠尾巴gDNA,分別采用兩對針對LoxPl.LoxP2位點的引物和針對野生型等位基因(WT)的引物進行PCR擴增和測序鑒定,證實BRD7LOxP1-2+/-小鼠構(gòu)建成功。
　　2.BRD7LoxP3+/+小鼠的構(gòu)建和鑒定
　　取BRD7LoxP1-2+/-小鼠雌雄雜交,分別以子代鼠gDNA為模板,采用針對LOxPl.LoxP2和WT的引物進行PCR擴增鑒定,獲得基因型為BRD7LoxP1-2+/+小鼠；然

8、后與EⅡ-Cre+/+小鼠雜交,通過PLoxPl、PLoxP2、PLoxP3、PWT和PCre五對引物對子代鼠進行PCR擴增和鑒定,獲得基因型為BRD7LoxP3+/-Cre+/-小鼠；再進一步與基因型為BRD7loxP1-2+/-Cre-/-小鼠雜交,獲得基因型為BRD7loxP3+/+即理論上的BRD7-/-小鼠。
　　3.BRD7基因剔除(KO)小鼠的鑒定
　　在成功構(gòu)建BRD7LoxP3+/+(BRD7-/-)小鼠的

9、基礎上,采用PLoxP3引物通過PCR擴增LoxP3片段,膠回收純化片段后直接測序,從gDNA層面證實BRD7的3-4號外顯子被成功剔除；進一步以基因型為BRD7LoxP1-2+/+和基因型為BRD7LoxP3+/+小鼠為研究模型,抽提大腸組織總RNA并逆轉(zhuǎn)錄,以BRD7全長引物和專針對Exon3-4外顯子的引物進行PCR擴增和產(chǎn)物的測序鑒定,從mRNA片段大小和序列特征方面證實BRD7基因剔除小鼠構(gòu)建成功；最后隨機抽取野生型小鼠和基因

10、剔除小鼠各兩只,抽提脾臟總RNA并逆轉(zhuǎn)錄,從mRNA和多組織層面證明BRD7剔除小鼠構(gòu)建成功。
　　4.BRD7基因剔除小鼠的大量繁殖
　　為了避免Cre本身對小鼠表型的影響,選擇BRD7loxP3+/LoxP1-2+EⅡ-Cre-/-小鼠同胞對之間進行雜交,大量繁殖BRD7基因剔除小鼠。目前已獲得BRD7-／-小鼠36只,BRD7+/-小鼠82只,BRD7+/+小鼠90只,為全面探討B(tài)RD7在小鼠中表型和分子機制奠定了堅實

11、基礎。
　　綜上所述,本研究發(fā)現(xiàn)了C57BL小鼠中BRD7與人BRD7具有高度的同源性,均編碼651個氨基酸,在小鼠全身各組織中泛表達,但在睪丸、附睪、精囊腺、生精管等雄性生殖相關的組織以及脾、肺、外耳等組織中表達較高。以C57BL小鼠為模型,采用Cre/LoxP系統(tǒng)構(gòu)建了BRD7基因剔除小鼠模型,探索了一種基因剔除小鼠構(gòu)建和鑒定的有效方法,大量繁殖了一批BRD7剔除小鼠、雜合子小鼠和野生型小鼠,為全面研究BRD7在體內(nèi)參與正常生