1、背景與目的：急性胰腺炎（AP）的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸是當今外科領域研究的熱點，其發(fā)病機理尚未完全闡明。其中急性膽源性胰腺炎（ABP）在我國發(fā)病率最高，占AP總數(shù)的50-80%。目前普遍認為，ABP是由于膽管炎癥、結(jié)石、寄生蟲、水腫、痙攣等病變使壺腹部發(fā)生梗阻，加之膽囊收縮，膽管內(nèi)壓力升高，膽汁通過共同通道反流入胰管，激活胰酶原，導致胰腺自身消化而引起胰腺炎。但其確切的發(fā)病機制尚未完全明確?？梢哉J為，隨膽汁異常反流入胰管的膽汁酸，造成胰腺腺泡

2、細胞功能與結(jié)構(gòu)損害是大多數(shù)ABP發(fā)病的一個關(guān)鍵性因素。因此，本研究探討膽汁酸7種不同成分對胰腺腺泡細胞的損傷作用，檢測在各種膽汁酸作用下胰腺腺泡細胞的存活率，凋亡/壞死的改變，觀察對腺泡細胞分泌功能的影響，并探究細胞核轉(zhuǎn)錄因子的DNA結(jié)合活性的變化，研究大黃素對膽汁酸誘導的胰腺腺泡細胞損傷的保護性作用；同時，進一步揭示急性膽源性胰腺炎大鼠發(fā)病中，膽汁酸對胰腺的損傷性作用及其機制，觀察中藥清胰湯的治療作用，為揭示急性膽源性胰腺炎的發(fā)病機制

3、和尋求更為有效的防治措施提供新的實驗佐證。 方法： 實驗一：以大鼠AR42J胰腺腺泡細胞系為研究對象，應用MTT方法檢測7種不同膽汁酸對細胞存活率的影響和劑量與時間依賴性關(guān)系，采用光學顯微鏡和熒光顯微鏡觀察細胞形態(tài)學改變與凋亡/壞死的變化，流式細胞術(shù)AV/PI雙染法檢測細胞的凋亡/壞死率。細胞經(jīng)0．4mM DCA作用15min，30min，1h，4h后分別收集細胞培養(yǎng)液上清檢測淀粉酶活性，提取細胞漿和細胞核蛋白，分別檢測

4、各組細胞漿淀粉酶的活性，利用Luminex檢測40種細胞核轉(zhuǎn)錄因子（TF）的DNA結(jié)合活性的變化。 實驗二：大黃素（Emodin）是治療急性胰腺炎中藥方劑的一種主藥，通過體外實驗觀察其對膽汁酸誘導的胰腺腺泡細胞損傷的保護性作用和影響。以大鼠AR42J胰腺腺泡系為研究對象，分為三組，分別為CON組，0．4mM DCA刺激組和0．4mM DCA+Emodin（20μM）干預組，利用流式細胞術(shù)AV/PI雙染法檢測各組細胞凋亡/壞死率，

5、以上各組進一步按照不同時間點分為4組：15min，30min，1h和4h，于相應時間點分別收集細胞培養(yǎng)液上清檢測淀粉酶活性，提取細胞漿和細胞核蛋白，分別檢測各組細胞漿淀粉酶的活性，利用Luminex檢測40種細胞核轉(zhuǎn)錄因子（TF）的DNA結(jié)合活性的變化。 實驗三：經(jīng)膽胰管逆行注入不同濃度去氧膽酸鈉制備大鼠急性水腫性胰腺炎（AEP）和急性壞死性胰腺炎（ANP）模型。40只SD大鼠隨機分為假手術(shù)組、AEP組、ANP組及對ANP的清胰

6、湯治療組（1ml/100g），每組10只。治療組大鼠于造模后立即一次和造模后12h再次給藥。24h后采取標本做病理檢查和各項指標檢測。光鏡下觀察各組胰腺標本病理改變，進行組織學評分；采用TUNEL技術(shù)檢測胰腺腺泡細胞的凋亡，計算凋亡指數(shù)；應用分光光度法檢測凋亡蛋白酶Caspase-3，8和9的活性變化。 結(jié)果：膽汁酸7中主要成分對胰腺腺泡細胞的損傷作用不同，其中DCA，CDCA，LCA和TDCA4種膽汁酸細胞毒作用明顯，呈劑量和

7、時間依賴性誘導腺泡細胞凋亡和壞死，CA，GCA和GDCA則不具有細胞毒作用。膽汁酸DCA和CA對腺泡細胞淀粉酶的合成與分泌功能均沒有顯著影響，在檢測的40種核轉(zhuǎn)錄因子（TF）的DNA結(jié)合活性中，DCA誘導AR42J胰腺腺泡細胞核內(nèi)ATF2，AR33，STAT5，NFAT，F(xiàn)KHR和NKX-2．5這6種核轉(zhuǎn)錄因子（TF）的DNA結(jié)合活性顯著升高，而RUNX/AML，NF-Y，MEF2和E2F1這4種TF的DNA結(jié)合活性則明顯下降，其余30

8、種TF活性沒有明顯變化。 20μM Emodin可以減少DCA誘導的AR42J胰腺腺泡細胞的凋亡與壞死，對細胞淀粉酶的合成與分泌功能沒有明顯影響，同DCA誘導的TF活性變化相比，Emodin升高PAX3，E2F1，RUNX/AML，NF-Y，IRF，MEF和NFAT這5種TF活性，降低FKHR的活性。 大鼠體內(nèi)實驗結(jié)果表明，AEP組與ANP組腺泡細胞凋亡指數(shù)、Caspase-3，8和9的活性均顯著高于假手術(shù)組，且AEP組

9、腺泡細胞凋亡指數(shù)及凋亡蛋白酶的活性水平顯著高于ANP組。同時，AEP組與ANP組病理組織學評分、血清淀粉酶、血清促炎性細胞因子等指標均較假手術(shù)組顯著升高，且ANP組顯著高于AEP組。清胰湯通過誘導凋亡蛋白酶活性升高使ANP組大鼠胰腺腺泡細胞凋亡增多而壞死減輕，從而減輕胰腺組織損害和炎癥因子水平。 結(jié)論：膽汁酸主要的7種成分中，DCA，CDCA，LCA和TDCA在0．3-0．4mM的較低濃度，在24h內(nèi)可導致大鼠AR42J胰腺腺泡

10、細胞存活率顯著下降，這種細胞毒作用呈時間和劑量依賴性關(guān)系，而CA，GCA和GDCA這3種膽汁酸則在1．0mM濃度內(nèi)不會損傷腺泡細胞。膽汁酸對腺泡細胞的損傷作用主要表現(xiàn)為凋亡和壞死，對細胞內(nèi)酶的合成和分泌功能沒有明顯影響。研究發(fā)現(xiàn)，DCA可誘導細胞6種TF的DNA結(jié)合活性顯著升高和4種TF的DNA結(jié)合活性顯著下降，從而影響相關(guān)基因的表達水平，是其造成細胞損傷的分子生物學基礎。因此，本研究為膽汁酸誘導的胰腺腺泡細胞損傷提供有力的實驗依據(jù)，并

11、揭示了膽汁酸7種不同成分的作用特點和可能機制，將為探討膽源性胰腺炎的發(fā)病機制和防治措施提供參考。 Emodin對膽汁酸誘導的胰腺腺泡細胞損傷有一定的保護性作用，對細胞淀粉酶的合成與分泌功能沒有明顯影響。通過調(diào)節(jié)細胞TF的DNA結(jié)合活性，從而改變相關(guān)基因和蛋白的表達．可能是其發(fā)揮保護性作用的分子機制。 急性膽源性胰腺炎時，膽汁酸誘導的胰腺腺泡細胞損傷時疾病發(fā)生的重要因素，腺泡細胞損傷主要表現(xiàn)為凋亡和壞死，且凋亡的多少與病