1、蚯蚓(Earthworm)在中醫(yī)藥中對感染性疾病的藥學、臨床學的醫(yī)治效果以及對蚯蚓組織提取物抗病毒作用研究的結(jié)果均提示，蚯蚓組織中存在著由多種因子組成的、能夠抑制、降解微生物和單細胞生物的分子系統(tǒng)，各分子相互協(xié)同，完成蚯蚓以微生物為食的消化、吸收功能。核酸酶類是這一分子體系中的一類必須的組成元件，其作用不僅與其消化作用有關(guān)，還是一種通過降解遺傳物質(zhì)，殺滅微生物的有效機制。 國內(nèi)外對核酸酶的生物學意義研究甚少，結(jié)論也不甚明確，目前

2、尚未見核酸酶與免疫及固有免疫、抗病毒等的系列研究報道。值得注意的是，以往的研究中證實了核酸酶在已發(fā)現(xiàn)的各種動物消化道中大量存在的事實，但均習慣性地認為與核酸的消化吸收有關(guān)。這一觀點與體內(nèi)的核苷酸代謝和核酸代謝相矛盾。因為在絕大多數(shù)的動物體內(nèi)，核苷酸的合成原料并不依賴消化道的吸收來提供，而是以氨基酸及其代謝產(chǎn)物為主要原料的“從頭合成”和“補救合成”途徑來滿足機體的需要。營養(yǎng)學的研究也不支持這種觀點，因為核苷酸及其代謝產(chǎn)物均不是人體的必需營

3、養(yǎng)素。那么消化道中種類如此齊全、活性很強的核酸酶應該還有其他重要的生物學意義，比如清除食物中的核酸、防止外源基因侵入、擬或殺滅病毒和微生物。原核生物中的限制性酶體系支持這種假設，它的基因“免疫”系統(tǒng)在保證遺傳穩(wěn)定性方面有著重要價值。 近年來對核酸酶與免疫系統(tǒng)的關(guān)系進行了初步研究，結(jié)果表明，核酸酶在各種免疫細胞中有著廣泛的分布和極高的活性，提示其與固有免疫有著密切的關(guān)系。為了進一步證實蚯蚓組織中核酸酶的種類、數(shù)量、酶學性質(zhì)、結(jié)構(gòu)以

4、及生物學功能及其作用機制，探索核酸酶在以微生物為食的多種生物中存在的普遍性、該酶類與免疫系統(tǒng)降解內(nèi)、外源廢棄細胞和微生物機制的關(guān)系，本文選擇蚯蚓作為研究模型，分四部分對蚯蚓組織中多種核酸酶進行了分離純化、理化性質(zhì)和酶學性質(zhì)研究，初步探索多種低等生物和免疫細胞中核酸酶的活性、數(shù)量和分布。各部分研究結(jié)果分別簡述如下： 一、蚯蚓組織核酸酶(EWDs和EWNs)的分離、純化 采用酶學、蛋白質(zhì)研究技術(shù)和核酸酶分析技術(shù)，首先對蚯蚓組

5、織核酸酶粗提液與提取、純化相關(guān)的理化、酶學性質(zhì)進行了研究，并用常壓、高效色譜系統(tǒng)研究了蚯蚓組織中具有核酸酶活性的各組分的層析行為和條件，確定了本文中酸性條件、有機溶劑和等電點沉淀的提取方案和陰離子、陽離子交換串聯(lián)層析結(jié)合PAGE電泳的高效、經(jīng)濟的純化技術(shù)路線，并用多種核酸酶活性分析技術(shù)對以上各酶進行了活性確定。結(jié)果表明，蚯蚓組織中存在3種DNA酶，分別命名為EWD<,1>(157kDa)、EWD<,2>(69.1kDa)、 EWD<,3

6、>(62.6kDa)，純度為電泳純： 5種核酸酶EWNl(EarthWorm Nuclease 1)、EWN<,2>(Earthworm Nuclease 2)、EWN<,3>(EarthwormNuclease 3)、EWN4(Earthworm Nuclease 4)、EWN<,5>(Earthworm Nuclease 5)，純度為層析純。以上發(fā)現(xiàn)尚未見報道。該研究為證明蚯蚓組織中核酸酶多樣性提供了可靠的實驗證據(jù)，并為進一步的酶學

7、、結(jié)構(gòu)、功能等研究提供了高純度的樣品，奠定了基礎。 二、蚯蚓組織中核酸酶(EWDs和EWNs)酶動力學、性質(zhì)和影響酶活性因素的研究 本部分研究采用Sephacryl-200柱層析、SDS-PAGE電泳、MALDI-TOF三種方法確定了EWD<,1>、EWD<,2>、EWD<,3>的分子量分別為157kDa、69.1kDa、62.6kDa。明顯大于已發(fā)現(xiàn)的DNase Ⅰ和DNaseⅡ。對EWDs和EWNs進行了溫度穩(wěn)定性、

8、pH穩(wěn)定性、激動劑、抑制劑研究，給出了各影響因素的參數(shù)，這些參數(shù)與已發(fā)現(xiàn)的各種DNases相比較有明顯差別。但三種EWDs的酶學性質(zhì)極為相似，理化性質(zhì)穩(wěn)定。酶動力學研究表明，三種EWDs的Km值分別為1.58、3.95和1.52mg/ml，表明EWD<,2>活性>EWD<,3>>EWD<,3>。EWNs具有RNA酶活性，其活性不依賴于Mg<'2+>、Ca<'2+>、Mn<'2+>等。以上結(jié)果提示，蚯蚓組織中已發(fā)現(xiàn)的核酸酶EWDs、EWN

9、s具有特殊的酶學特征。其作用機理和分類有待于進一步的研究和歸類。 三、蚯蚓組織核酸酶(EWDs和EWNs)作用機制的研究 本部分采用ZORBAX-Oligo柱-HPLC、瓊脂糖電泳、紫外分光光度法等分析技術(shù)，進行了EWDs、EWNs對環(huán)狀、線狀DNA、單鏈DNA的降解中間產(chǎn)物和終產(chǎn)物的觀察和分析。結(jié)果表明，EWDs、EWNs對所有的形式的DNA底物均有降解作用，降解產(chǎn)物為較均一的、<18bp的寡核苷酸，各酶的降解終產(chǎn)物無

10、明顯長度差異。EWNs同時還具有降解RNA底物的作用，EWDs無此作用。結(jié)果提示，EWDs為脫氧核糖核酸內(nèi)切酶類(DNases)，EWNs為非特異性核酸酶(Nucleases)。 四、雙胸蚓組織中核酸酶的生物學作用及其機制的研究 用瓊脂糖電泳DNA酶活性測定法研究了與蚯蚓生活習性相近的幾種低等生物組織提取液中核酸酶的活性分布；同時研究了幾種主要的免疫細胞中DNA酶的活性分布情況，結(jié)果表明，紅線蟲、水蚤、黃粉蟲等低等生物的

11、組織提取液中，含有高活性的DNA酶。研究的幾種免疫細胞中，包括白細胞、淋巴細胞、巨噬細胞中均存在大量的、高活性的核酸酶。 結(jié)論： 1.建立了分離、純化蚯蚓組織核酸酶的技術(shù)路線，并分離出3種DNA酶，分別名為EWD<,1>(157kDa)、EWD<,2>(69.1kDa)、EWD<,3>(62.6kDa)，純度為電泳純； 5種核酸酶EWNl(Earthworm Nuclease 1)、EWN2(Earthworm Nucl

12、ease 2)、EWN<,3> (Earthworm Nuclease 3)、 EWN<,4> (Earthworm Nuclease 4)、 EWN<,5>(Earthworm Nuclease 5)，純度為層析純； 2.對蚯蚓組織中核酸酶(EWDs和EWNs)酶動力學性質(zhì)和影響酶活性因素進行了研究，結(jié)果表明，蚯蚓組織純化的三種DNA酶(EWD<,1>、EWD<,2>、EWD<,3>)的分子量分別為157 kDa、69.1 k

13、Da和62.6 kDa，作用底物是DNA，包括雙鏈DNA、單鏈DNA、環(huán)狀DNA和線狀DNA，最適pH值在4.0～5.6之間，對溫度較為敏感，55℃時，失去DNA酶活性，Mn<'2+>、Ca<'2+>為其活性抑制劑，Mg<'2+>對酶的活性無明顯影響； 3.首次用采用ZORBAX-Oligo柱-HPLC等分析技術(shù)對EWDs、EWNs的底物特異性和降解行為進行了研究，結(jié)果表明，EWDs、EWNs對所有的形式的DNA底物均有降解作用