1、血吸蟲病是一個嚴重的全球性公共衛(wèi)生問題，全球每年超過6億人口受到血吸蟲感染的威脅，約2億人口被感染。目前，控制血吸蟲病的主要策略是用安全有效的藥物對感染人群進行化療，但化療并不能預(yù)防人群的反復(fù)再感染，致使疫情易于反彈。當前，國家提出現(xiàn)階段以控制傳染源為主的綜合防治新策略，對于湖區(qū)血吸蟲病疫情的控制將起到重要的作用。日本血吸蟲(Sj)的一個顯著特點是雌雄異體但又終生合抱。雌雄合抱是血吸蟲生長發(fā)育、成熟、產(chǎn)卵的前提，而蟲卵是造成病理損害和病

2、原體傳播的關(guān)鍵因素。阻斷傳播型抗血吸蟲卵胚發(fā)育和抗雌蟲生殖產(chǎn)卵的研究，一直是本課題組的重要攻關(guān)內(nèi)容。在1999年-2000年我國總理基金血防重點項目結(jié)題后進行的全國血吸蟲疫苗免疫保護統(tǒng)一檢測實驗中，由本室構(gòu)建的天然分子疫苗(1號疫苗)在全國16種候選疫苗中獲得了最佳的動物保護效果。本文在此研究基礎(chǔ)上，利用雙向電泳和質(zhì)譜技術(shù)，鑒定了9個日本血吸蟲雌雄合抱相關(guān)蛋白，從中選用編碼血吸蟲雌雄合抱相關(guān)蛋白SJCHGC基因為疫苗候選分子，進行克隆、

3、表達及DNA疫苗構(gòu)建，以考核其作為抗日本血吸蟲病疫苗候選分子的潛在價值，為抗日本血吸蟲雌雄合抱和抗生殖疫苗的制備及應(yīng)用提供實驗依據(jù)。 研究方法: 1)利用雙向凝膠電泳和MALDI—TOF質(zhì)譜分析等蛋白質(zhì)組學(xué)方法，對比研究了日本血吸蟲雄蟲在合抱與未合抱狀態(tài)下蛋白質(zhì)表達上的差異，并在mRNA水平進行進一步驗證。 2)采用生物信息學(xué)等技術(shù)對獲得的日本血吸蟲雌雄合抱相關(guān)蛋白SJCHGC(Sj22.7)編碼基因序列進行開放

4、閱讀框(ORF)的尋找，編碼氨基酸的推導(dǎo)，蛋白質(zhì)同源性比較以及二、三級結(jié)構(gòu)的預(yù)測。 3)通過用陽離子脂質(zhì)體Lipofectamine2000將重組質(zhì)粒DEGFP-Cl/SJCHGC轉(zhuǎn)染COS-7細胞，用熒光顯微鏡直接觀察pEGFP-Cl/SJCHGC融合蛋白在細胞中的分布和定位，用RT-PCR、SDS-PAGE和Western blot方法驗證其mRNA和蛋白的表達。 4)用PCR特異性擴增SJCHGC基因，將其克隆入真

5、核表達載體DcDNA3，構(gòu)建DNA疫苗pcDNA3/SJCHGC，并通過PCR、雙酶切及測序鑒定。將pcDNA3/SJCHGC經(jīng)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染Hela細胞，檢測SJCHGC蛋白的體外瞬時表達。免疫接種并攻擊感染小鼠，檢測重組質(zhì)粒在小鼠肌肉組織中的表達情況，以減蟲率、減卵率和每雌肝卵數(shù)評價其免疫保護性。 5)用DNA疫苗pcDNA3/SJCHGC免疫接種并攻擊感染小鼠，通過ELISA法測定血清中總IgG抗體水平，并以Western b

6、lot分析抗SJCHGC特異性抗體。四甲基偶氮唑鹽試驗(MTT法)檢測免疫小鼠T淋巴細胞增殖反應(yīng)。攻擊感染后以脾細胞培養(yǎng)法檢測經(jīng)血吸蟲雄蟲可溶性抗原(AWAm)刺激后，小鼠脾細胞分泌IFN-γ和IL-4的水平。 結(jié)論: 1)建立了日本血吸蟲合抱前后雄蟲雙向凝膠電泳圖譜，并應(yīng)用質(zhì)譜技術(shù)成功鑒定了9個血吸蟲雄蟲合抱相關(guān)的差異表達蛋白質(zhì)，其功能涉及血吸蟲的生長發(fā)育、生殖、營養(yǎng)、運動、信號傳遞等過程。為血吸蟲蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫的建立

7、提供了有意義的數(shù)據(jù)，為揭示日本血吸蟲雌雄合抱的機制提供新的線索和思路。 2)生物信息學(xué)分析示：SJCHGC的編碼蛋白含有2個Efh(EF-hand)保守結(jié)構(gòu)功能域，即鈣結(jié)合基序，屬于鈣傳感器和鈣調(diào)節(jié)基因的超家族成員，存在多個潛在抗原表位與特定功能位點，可能為一重要的胞漿內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子。屬首次發(fā)現(xiàn)并報導(dǎo)的與日本血吸蟲雌雄合抱相關(guān)的蛋白質(zhì)，進一步研究其功能具有重要的生物學(xué)意義。 3)重組質(zhì)粒pEGFP-C1/SJCHGC轉(zhuǎn)染

8、COS-7細胞，可用熒光顯微鏡直接觀察pEGFP-C1/SJCHGC融合蛋白在COS-7細胞中的表達和胞漿中亞細胞定位，細胞所表達的融合蛋白具有血吸蟲抗原性，為該基因功能研究提供了線索。 4)DNA疫苗pcDNA3/SJCHGC可誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生較顯著的抗血吸蟲攻擊感染的免疫保護力，減蟲率為29.70％，肝減卵率為47.25％，腸減卵率為51.77％，每雌肝減卵率為25.90％，具有明顯的抗雌蟲生殖能力。提示，該核酸疫苗可作為新的有