1、血吸蟲(chóng)病是一種分布廣泛、危害嚴(yán)重的人畜共患病。目前可以通過(guò)藥物對(duì)感染血吸蟲(chóng)病的個(gè)體進(jìn)行治療,但是藥物治療不能很好地解決重復(fù)感染的問(wèn)題,也不能有效的預(yù)防血吸蟲(chóng)病的發(fā)生,所以血吸蟲(chóng)病疫苗的研發(fā)顯得尤為重要。在血吸蟲(chóng)生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中雌雄蟲(chóng)合抱尤為關(guān)鍵,血吸蟲(chóng)抱雌溝蛋白是一種可在雌雄蟲(chóng)合抱過(guò)程中進(jìn)行傳遞并影響雌雄蟲(chóng)合抱的物質(zhì)。因此,血吸蟲(chóng)抱雌溝蛋白及與其相互作用蛋白的研究對(duì)血吸蟲(chóng)生長(zhǎng)發(fā)育機(jī)制的探索及新疫苗的開(kāi)發(fā)具有重要意義。
　　 本論文

2、研究工作首先分析了日本血吸蟲(chóng)抱雌溝蛋白功能,然后在本實(shí)驗(yàn)室前期利用酵母雙雜交技術(shù)篩選出多個(gè)與日本血吸蟲(chóng)抱雌溝蛋白相互作用陽(yáng)性克隆的基礎(chǔ)上,通過(guò)回復(fù)雜交實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了部分克隆與抱雌溝蛋白間的相互作用,并從中挑選兩個(gè)基因進(jìn)行了進(jìn)一步的研究。論文具體研究工作如下:
　　 一、抱雌溝蛋白功能分析及其相互作用蛋白的鑒定
　　 利用RNAi和表達(dá)譜芯片技術(shù)對(duì)抱雌溝蛋白功能進(jìn)行分析,結(jié)果顯示抱雌溝蛋白可能是一種細(xì)胞粘附蛋白,對(duì)血吸蟲(chóng)的生長(zhǎng)

3、發(fā)育及代謝等生物學(xué)進(jìn)程產(chǎn)生重要影響。另外,本實(shí)驗(yàn)室前期研究成功構(gòu)建了18日齡日本血吸蟲(chóng)酵母雙雜交cDNA預(yù)雜交文庫(kù),并利用該技術(shù)篩選到與日本血吸蟲(chóng)抱雌溝蛋白相互作用的383個(gè)陽(yáng)性克隆,對(duì)序列分析整合后得到45條不同的基因序列。為了排除假陽(yáng)性,對(duì)篩選到的基因進(jìn)行了酵母體系相互作用驗(yàn)證,結(jié)果得到16個(gè)與抱雌溝蛋白相互作用的基因,并排除了4個(gè)假陽(yáng)性克隆,相互作用分子中12個(gè)為已在GenBank登陸的基因,另外4個(gè)為未知基因。
　　 二

4、、SjGALE基因的研究
　　 首次克隆并表達(dá)了SjGALE基因,利用real-time RT-PCR和Western blot考查了該基因在日本血吸蟲(chóng)不同時(shí)期的表達(dá)情況,結(jié)果顯示該基因在日本血吸蟲(chóng)的各個(gè)時(shí)期均有表達(dá),23d成蟲(chóng)體內(nèi)表達(dá)水平最高。免疫組化實(shí)驗(yàn)表明該蛋白主要分布于日本血吸蟲(chóng)體被,少量存在于蟲(chóng)體內(nèi)部組織。為了考查SjGALE的免疫保護(hù)效果,利用rSjGALE免疫小鼠后進(jìn)行攻擊感染,結(jié)果減蟲(chóng)率和減卵率分別為34％和49

5、％,每只雌蟲(chóng)對(duì)肝臟蟲(chóng)卵負(fù)荷貢獻(xiàn)率降低63％,并且產(chǎn)生了高水平的特異性抗體。IgG抗體亞型分析發(fā)現(xiàn),rSjGALE免疫小鼠后的30-90天內(nèi)IgG1／IgG2a的數(shù)值逐漸降低,說(shuō)明rSjGALE免疫小鼠后引起Th1型免疫反應(yīng)。進(jìn)一步的細(xì)胞因子實(shí)驗(yàn)分析發(fā)現(xiàn),免疫小鼠的脾細(xì)胞經(jīng)rSjGALE蛋白刺激后IFN-γ,TNF-α和IL-10細(xì)胞因子含量較對(duì)照組顯著升高,IL-4的水平?jīng)]有明顯變化,進(jìn)一步證實(shí)rSjGALE介導(dǎo)了Th1保護(hù)性免疫反應(yīng)。

6、
　　 三、日本血吸蟲(chóng)新基因Si34.9的研究
　　 Sj34.9是經(jīng)驗(yàn)證與日本血吸蟲(chóng)抱雌溝蛋白具有相互作用的分子,且該分子在之前的工作中從未被報(bào)道。為深入研究該分子的生物學(xué)功能,本研究利用酵母雙雜交所得該陽(yáng)性克隆的已知部分序列,利用RACE技術(shù)擴(kuò)增得到其全長(zhǎng)cDNA.其完整cDNA序列1514 bp,含有完整的ORF966 bp,編碼321個(gè)氨基酸,理論分子量為34.9 kDa,等電點(diǎn)為9.38。經(jīng)查詢(xún)表明該基因?yàn)槿毡?/p>

7、血吸蟲(chóng)新基因,將其cDNA序列上傳GenBank,命名為sj34.9,登陸號(hào)為:JF907494。利用Real-time PCR分析了Sj34.9基因在血吸蟲(chóng)不同時(shí)期的表達(dá)情況,結(jié)果顯示該基因在血吸蟲(chóng)各個(gè)時(shí)期幾乎穩(wěn)定表達(dá),且雌蟲(chóng)體內(nèi)該基因的轉(zhuǎn)錄水平高于雄蟲(chóng)。利用rSj34.9蛋白免疫小鼠后攻擊感染日本血吸蟲(chóng)尾蚴,通過(guò)蟲(chóng)卵數(shù)的統(tǒng)計(jì)考查該重組蛋白的免疫保護(hù)作用,結(jié)果發(fā)現(xiàn)rSj34.9蛋白不具有減蟲(chóng)作用,減卵率為28.9％。利用RNAi技術(shù)成

8、功對(duì)Sj34.9基因在血吸蟲(chóng)體內(nèi)的表達(dá)進(jìn)行了干擾,利用血吸蟲(chóng)的寡聚核苷酸表達(dá)譜芯片分析了Sj34.9基因表達(dá)沉默后血吸蟲(chóng)基因的表達(dá)情況。結(jié)果顯示,RNAi組與對(duì)照組相比,顯著差異表達(dá)的基因共378個(gè),其中上調(diào)基因202個(gè),下調(diào)基因176個(gè)；通路分析顯示,差異基因主要與物質(zhì)代謝,信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及信號(hào)分子間相互作用有關(guān)；基因本體論(GO)分類(lèi)結(jié)果顯示,多數(shù)基因與分子間結(jié)合,膜的構(gòu)成,細(xì)胞過(guò)程和機(jī)體的生長(zhǎng)發(fā)育及代謝相關(guān)。因而推測(cè)Sj34.9基因可能