1、近年來的基礎和臨床研究提示內皮祖細胞(endothelialProgenitor cells，EPCs)可以治療缺血性心臟病以及各種疾病引起的肢體缺血，也可以用于組織工程的血管構建，或者作為基因治療的載體和腫瘤治療的新靶點等。由于內皮祖細胞的諸多優(yōu)點及其廣泛的應用前景，使得內皮祖細胞成為各國學者研究的熱點。從而建立了一些分離、培養(yǎng)、鑒定的方法，并且對于內皮祖細胞的增殖的特性也有了一些研究和了解。然而大部分的文獻是對外周血和臍帶血來源的內

2、皮祖細胞的研究，對于骨髓來源的內皮祖細胞的培養(yǎng)、增殖特性研究甚少。 研究目的：建立優(yōu)化的小鼠骨髓內皮祖細胞的培養(yǎng)方法、研究小鼠骨髓內皮祖細胞的集落形成能力和增殖潛能以及GM-CSF對小鼠骨髓內皮細胞的促增殖作用。 研究方法：用本實驗室配制的內皮細胞培養(yǎng)基(Endo-M)培養(yǎng)小鼠骨髓內皮祖細胞，通過Wright’s Giemsa、免疫熒光法觀察內皮祖細胞的形態(tài)及表型；MTT法、劃痕實驗及不同濃度：Endo-M培養(yǎng)液對內皮細

3、胞集落生成的影響觀察：Endo-M對內皮細胞增殖的影響；通過內皮細胞的傳代培養(yǎng)觀察內皮祖細胞集落形成能力及增殖潛能；加入不同濃度的GM-CSF，通過集落形成率、MTT法和流式細胞儀檢測內皮細胞生長周期等方法來觀察GM-CSF對小鼠骨髓內皮細胞增殖的作用。 實驗結果：(1)內皮細胞培養(yǎng)基 (Endo-M)誘導的骨髓細胞可以生成內皮細胞，vWF檢測陽性。(2)MTT實驗以及劃痕實驗結果表明Endo-M組與對照組相比，P均小于0.05

4、，有顯著性差異。說明Endo-M培養(yǎng)液對內皮細胞的促增殖作用明顯。內皮細胞以較低濃度種植時可形成集落，Endo-M培養(yǎng)液對內皮細胞集落的多少沒有影響，對內皮細胞集落的大小影響顯著。(3)骨髓來源的內皮祖細胞具有等級性，可分為四個等級：高增殖潛能內皮集落形成細胞(HPP-ECFCs)、低增殖潛能內皮集落形成細胞(LPP-ECFCs)、內皮細胞叢(EndothelialCell C1uster)、成熟分化的內皮細胞(Mature Diffe

5、rentiatedEdothelium)。HPP-ECFCs可以進行再種植和第三次種植并形成集落。內皮細胞整體的增殖能力顯示經過 5 次傳代，內皮細胞增殖了516.574±71.36倍。觀察小鼠骨髓內皮細胞不同代次的增殖能力與不同代次集落增殖的比較，顯示隨著傳代的進行，內皮祖細胞的增殖潛能和集落形成能力是逐漸下降的。(4)加入不同濃度的GM-CSF,通過觀察集落形成率和MTT法均證實了GM-CSF對內皮細胞的增殖具有明顯的促進作用。流式

6、細胞儀檢測結果顯示了GM-CSF處理組的細胞進入S期的比率為9.3％，對照組為2.1％，說明GM-CSF可以通過促使內皮細胞進入S期，加快了細胞的分裂，從而促進了細胞的增殖。比較第一代和第四次傳代后細胞的生長曲線，兩者無明顯差別，說明多次傳代后的內皮細胞仍保持傳代早期內皮細胞的增殖潛能。 結論：1．骨髓中內皮祖細胞具有等級性。 2．骨髓內皮祖細胞有巨大的增殖潛能。 3．骨髓內皮祖細胞的增殖潛能隨傳代次數的增加而逐