1、腎間質(zhì)纖維化(tubulointerstitial fibrosis，TIF)是各種腎臟疾病進展至腎功能衰竭的共同途徑，涉及腎臟固有細胞及炎性細胞的激活和功能異常等一系列病理生理過程，與細胞因子、生長因子、血管緊張素II、內(nèi)皮素、補體、蛋白分解酶、鐵、活性氧、磷以及梗阻相關(guān)因素等密切相關(guān)。近年的研究發(fā)現(xiàn)，蛋白尿在TIF的進展中同樣具有重要作用，尿中超過正常范圍的蛋白既是腎臟疾病的標志，也是腎間質(zhì)纖維化病情發(fā)展的最重要的獨立危險因素之一

2、。 正常情況下終尿中的總蛋白含量不超過150mg／24小時，成分有：免疫球蛋白(IgG、IgA、IgM以及補體等)，白蛋白，微球蛋白(α、β)，THP，視黃醇結(jié)合蛋白(RBP)，以及各種具有生物活性的酶等。其中白蛋白占40％，免疫球蛋白片段15％，其他血漿蛋白5％，腎和泌尿生殖系組織蛋白40％。在疾病情況下，尿中蛋白的含量增加，組成也發(fā)生顯著改變。這種尿蛋白含量和組成的改變勢必對腎臟固有細胞產(chǎn)生毒性作用，引起腎臟炎癥反應(yīng)及纖維化

3、的發(fā)生。目前的研究證實主要通過以下幾個途徑對腎小管間質(zhì)產(chǎn)生損傷作用：(1)大量蛋白通過濾過膜時對濾過膜本身造成機械損傷；(2)在腎小管內(nèi)形成管型阻塞腎小管可直接和間接降低GFR；(3)蛋白的重吸收過程具有競爭性，若一種小分子蛋白濾過增加，將影響其他蛋白重吸收，從而改變腎小管的正常功能；(4)腎小管蛋白負荷過重，細胞內(nèi)過多的蛋白激活多種細胞因子，啟動了間質(zhì)炎癥反應(yīng)；(5)氮代謝產(chǎn)物氨、一氧化氮(NO)、補體、抗體和溶酶體酶也參與了間質(zhì)纖維

4、化；(6)通過上調(diào)血管緊張素原和ACE表達，下調(diào)腎素的基因表達使腎內(nèi)Ang Ⅱ生成增加；(7)激發(fā)腎小管上皮細胞內(nèi)活性氧的產(chǎn)生，引起氧化 應(yīng)激損傷?？诜Ｑ灏椎鞍字谱鞯牡鞍啄騽游锬Ｐ妥C實蛋白尿的程度與間質(zhì)炎癥及纖維化密切相關(guān)。腎小球來源的尿蛋白可通過多種途徑引起小管間質(zhì)損傷，其中誘導(dǎo)腎小管細胞分泌細胞因子及趨化物質(zhì)，引起間質(zhì)炎癥細胞浸潤是蛋白尿引起腎小管損傷、間質(zhì)纖維化的重要途徑。許多學(xué)者在研究中發(fā)現(xiàn)白蛋白、IgG、轉(zhuǎn)鐵蛋白、脂蛋白、

5、補體等均可刺激或損傷腎小管細胞，引起腎小管細胞分泌多種細胞因子和生長因子(MIF、MCP-1、ET-1、RANTES、OPN、GM-CSF、IL-1、IL-6、IL-8、PDGF、TNF-α、TGF-β等)。 由于以往絕大多數(shù)體外試驗都用血清白蛋白或純化白蛋白作為尿蛋白的代表進行研究，而實際尿蛋白的組成很復(fù)雜，用單一的蛋白成分并不能完全代表體內(nèi)蛋白尿中多種成分的共同效應(yīng)。LN患者的尿蛋白成分非常復(fù)雜，其中包括有免疫球蛋白、白蛋白

6、、轉(zhuǎn)鐵蛋白、β2—微球蛋白、Tamm-Horsfall蛋白(THP)、視黃醇結(jié)合蛋白(RBP)、溶菌酶等，提示LN患者的尿蛋白對小管間質(zhì)的損傷可能更嚴重。為進一步明確系統(tǒng)性紅斑狼瘡腎炎(LN)患者尿蛋白對PTC的作用及其對腎間質(zhì)炎癥、纖維化的影響，我們提取了LN患者蛋白尿中的總蛋白成分，觀察其在刺激體外培養(yǎng)的人近端腎小管上皮細胞(PTC)轉(zhuǎn)分化過程中，是否有TGF-β／Smads信號通路的激活?如果有，使用TGF-β1中和抗體后，是否可

7、以阻斷尿蛋白誘導(dǎo)的腎小管上皮細胞轉(zhuǎn)分化?是否還有其他的通路在起作用?通過本研究，以期為臨床預(yù)防和治療狼瘡腎炎纖維化的發(fā)生、發(fā)展提供新思路和理論依據(jù)。 本實驗的目的在于： 1、探討狼瘡腎炎(LN)患者尿蛋白介導(dǎo)人近端腎小管上皮細胞(HK-2)發(fā)生轉(zhuǎn)分化的分子信號機制。 2、使用TGF-β1中和抗體后，對尿蛋白誘導(dǎo)的腎小管上皮細胞轉(zhuǎn)分化的影響。 材料與方法 1、初發(fā)LN患者6例，男1例，女5例，平均年

8、齡27.4歲。均符合1982年美國風(fēng)濕病學(xué)會制定的SLE的診斷標準。所有患者的尿蛋白均>1g/d，并經(jīng)腎活檢證實為LN，臨床尚未開始腎上腺皮質(zhì)激素和(或)細胞毒藥物治療。 2、收集LN患者24小時尿液，提純尿蛋白，冰凍干燥，-20℃保存。 3、HK-2細胞用含10％FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)，鏡下觀察細胞長至融合度約80％-90％時換用無血清培養(yǎng)基同步24小時，隨機分為四組：A組細胞和1mg/ml尿蛋白共培養(yǎng)0、

9、1、3、6、12、24、48小時,B組細胞和0、0.1、0.5、1.0、2.5、5.0、l0.Omg/ml尿蛋白共培養(yǎng)24小時，C組細胞在1mg/ml尿蛋白刺激前30min加入TGF-β1中和抗體(5μg/ml)，D組細胞為對照組，在1mg/ml尿蛋白刺激前30min加入和TGF-β1中和抗體相同來源(小鼠)的IgG對照(5μg/ml)。 4、收取細胞總RNA及蛋白進行RT-PCR和Western印跡檢測TGF-β1、P-Sma

10、d2/3、α-SMA，間接免疫熒光檢測P-Smad2/3在細胞核內(nèi)的表達，ELISA檢測細胞培養(yǎng)上清液中TGF-β1的表達。 5、所有計量資料以均數(shù)±標準差表示，根據(jù)方差齊性檢驗結(jié)果組間比較采用獨立樣本t檢驗。所有數(shù)據(jù)均用SPSS11.0統(tǒng)計學(xué)軟件處理，P＜0.05認為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，P＜0.01認為差異具有顯著的統(tǒng)計學(xué)意義。 結(jié)果 1、LN患者1mg/ml尿蛋白可刺激HK-2細胞上調(diào)TGF-β<,1>mRN

11、A、α-SMA、P-Smad2/3蛋白和mRNA的表達，并呈時間依賴性。 2、LN患者不同濃度的尿蛋白刺激HK-2細胞24小時可上調(diào)α-SMA、P-Smad2/3蛋白和mRNA的表達，并呈劑量依賴性。 3、與刺激前相比較，10mg/ml尿蛋白作用24小時后，可上調(diào)HK-2細胞P-Smad2/3核轉(zhuǎn)位。 4、ELISA檢測結(jié)果顯示，1mg/ml尿蛋白作用HK-2細胞0h、12h、24h、48h，細胞培養(yǎng)上清液中TG

12、F-β1表達逐漸增高，48h達高峰。 5、使用TGF-β1中和抗體可顯著抑制α-SMA、P-Smad2/3蛋白和mRNA的表達。 結(jié)論 綜上所述，本研究得出以下結(jié)論： 1、狼瘡腎炎患者尿蛋白刺激近端腎小管上皮細胞轉(zhuǎn)分化過程中有TGF-β／Smads信號系統(tǒng)的活化，并可誘導(dǎo)。腎小管細胞發(fā)生表型轉(zhuǎn)化?；罨哪I小管上皮細胞可能轉(zhuǎn)化為肌成纖維母細胞，從而加重腎間質(zhì)纖維化。 2、使用TGF-βl中和抗體可顯