1、本研究分為三部分： 第一部分：自制腹透管尿毒癥大鼠腹膜透析模型的建立 目的： 建立腺嘌呤尿毒癥大鼠模型，在此基礎(chǔ)上研究自制腹透管和手術(shù)方式建立尿毒癥大鼠腹膜透析模型。 方法： SD大鼠用含有7500mg·kg-1腺嘌呤的顆粒飼料喂養(yǎng)，投放量為300mg/(kg·d)，連續(xù)喂養(yǎng)7w，檢測血清尿素氮、肌酐和腎臟病理確定尿毒癥鼠模型的建立是否成功。 結(jié)果： 1、腹透管完整性比較：自制1組

2、、傳統(tǒng)頭皮針組大鼠腹透管完好，無管道破損和滲漏 2、出口處和隧道口感染情況：自制1組3例，自制2組2例，傳統(tǒng)頭皮針組6例發(fā)生隧道口感染。 3、腹膜炎發(fā)生情況：自制1組1例，自制2組7例，傳統(tǒng)頭皮針組3例發(fā)生腹膜炎。 4、腹透液排出情況：自制1組第1天與第15天相比腹膜透析出液量無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異 5、15天后自制1組腹膜透析管腹腔端被大網(wǎng)膜完全包裹1例、部分包裹5例，傳統(tǒng)頭皮針組完全包裹4例、部分包裹6例。

3、 結(jié)論： 1、采用自制硅膠吸痰管作為腹透管，外口使用一次性無菌輸液接頭連接，腹透管出口由后背頸部皮膚穿出的手術(shù)方式構(gòu)建的尿毒癥大鼠腹膜透析模型，具有成功率高的特點(diǎn)。 2、正確的手術(shù)方式，是模型建立的基本保證，而透析管道的選材、接頭穩(wěn)固耐用是腹膜透析模型能否長期使用的關(guān)鍵。 第二部分：體內(nèi)實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)一、燈盞花素對尿毒癥大鼠腹膜透析效能以及腹膜結(jié)構(gòu)的影響 目的： 觀察燈盞花素對尿毒癥大鼠腹

4、膜透析效能以及腹膜結(jié)構(gòu)的影響。 方法： 將采用含腺嘌呤喂養(yǎng)制作尿毒癥模型，隨后采用自制腹透管行腹膜透析置管術(shù)制作腹膜透析模型，使用LPS加入腹腔建立尿毒癥大鼠腹膜透析UFF模型。 結(jié)果： 1.腹膜效能及腹膜超濾量的影響： 2.大鼠腹膜組織病理變化： 結(jié)論：燈盞花素具有防止腹膜間皮細(xì)胞損傷，維持腹膜結(jié)構(gòu)的完整性，改善局部微循環(huán)，提高腹膜的超濾效能等作用。以高、中濃度燈盞花素組為好。

5、實(shí)驗(yàn)二、燈盞花素對大鼠腹膜間皮細(xì)胞TLR4基因表達(dá)及信號通路的影響 目的： 探討TLR4及其信號通路在腹膜失超濾中所起的作用，并且觀察燈盞花素對其干預(yù)作用。 方法： 取實(shí)驗(yàn)一各組大鼠腹膜，免疫組化方法檢測腹膜組織TLR4蛋白表達(dá)；采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測TLR4mRNA的表達(dá)情況；ELISA方法檢測腹透液中MCP-1、MIP-2的濃度變化。 結(jié)果： 1.腹膜組織TLR4m

6、RNA的表達(dá)： 2.組織細(xì)胞TLR4蛋白的免疫組織化學(xué)的表達(dá)： 3.腹透液MCP-1、MIP-2濃度的變化(ELISA)： 結(jié)論： 1.腹膜透析腹膜組織TLR4的表達(dá)量與腹透液中MCP-1、MIP-2濃度呈正相關(guān)，并與腹膜問皮細(xì)胞受損程度正相關(guān)。 2.燈盞花素對于TLR4的表達(dá)，以及由于TLR4激活所產(chǎn)生的MCP-1、MIP-2炎癥因子具有下調(diào)效應(yīng)。 第三部分：體外實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)一、燈

7、盞花素對腹膜間皮細(xì)胞生長和增殖的影響 目的： 本研究旨在通過觀察體外培養(yǎng)時(shí)燈盞花素對大鼠腹膜間皮細(xì)胞生長和增殖的影響，探討間皮細(xì)胞受損的機(jī)制。 方法： 對SD大鼠腹膜間皮細(xì)胞進(jìn)行分離培養(yǎng)，間皮細(xì)胞分成8組，分別加入燈盞花素和LPS，包括：單純培養(yǎng)基組(1組)、50ul燈盞花素組(2組)、25ul燈盞花素組(3組)、12.5ul燈盞花素組(4組)、50ul燈盞花素+10ulLPS組(5組)、25ul燈盞花素

8、+10ulLPS組(6組)、12.5ul燈盞花素+10ulLPS組(7組)、10ulLPS組(8組)。培養(yǎng)48小時(shí)和72小時(shí)后通過細(xì)胞計(jì)數(shù)了解間皮細(xì)胞生長情況；培養(yǎng)72小時(shí)后加入MTT5mg/孔，用酶標(biāo)儀490nm比色，了解間皮細(xì)胞增殖情況。 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：數(shù)據(jù)以均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示。應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件，單因素組間比較采用OneWayANOVE、SNK檢驗(yàn)，多組間比較采用重復(fù)檢驗(yàn)方差分析。 結(jié)果：

9、1.細(xì)胞數(shù)量影響：間皮細(xì)胞培養(yǎng)48小時(shí)和72小時(shí)后進(jìn)行計(jì)數(shù)組間存在顯著性差異(F=182.738，P=0.000；F=677.589，P=0.000)，各個加藥組間也存在顯著性差異(F=606.988，P=0.000)。在未加LPS組中，3組(中等劑量)和4組(低劑量燈盞花素組)間皮細(xì)胞生長良好，與1組(對照組)相比無顯著性差異(P=0.086，1.000)；2組(高濃度組)與1組相比具有顯著性差異(P=0.004)。而加LPS組間皮細(xì)

10、胞生長情況差于未加組，在LPS組中，加入5組(燈盞花素高濃度組)、6組(中濃度組)和7組(低濃度組)對LPS對間皮細(xì)胞生長抑制作用具有拮抗作用(P=0.000)。 2.細(xì)胞增殖的影響：加藥組間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=1265.008，P=0.000)。未加LPS組中1、3、4組的間皮細(xì)胞增殖無顯著差異(P=0.64，0.929)，2組的間皮細(xì)胞增殖與3、4組比較無顯著性差異(P=0.705)，與1組比較存在顯著性差異(P=0.039

11、)。加有LPS組中5、6組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.771)，其余各組間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.000)，其中8組間皮細(xì)胞增殖最差，7組次之。 結(jié)論： 1.燈盞花素對于間皮細(xì)胞的生長和增殖具有保護(hù)作用。 2.燈盞花素能夠減輕LPS引起的免疫炎癥造成的間皮細(xì)胞的損傷，且存在量效正相關(guān)關(guān)系。 實(shí)驗(yàn)二、燈盞花素對腹膜間皮細(xì)胞TLR4表達(dá)及信號通路的影響 目的： 觀察體外腹膜間皮細(xì)胞TLR4以及信號

12、通路的表達(dá)情況，研究燈盞花素對TLR4的信號通路以及相關(guān)信號因子影響的分子機(jī)制。 方法： 體外進(jìn)行間皮細(xì)胞培養(yǎng)，分組同體外實(shí)驗(yàn)一，給予燈盞花素和LPS進(jìn)行干預(yù)，72小時(shí)后采用RT-PCR法對間皮細(xì)胞TLR4mRNA表達(dá)進(jìn)行檢測；采用ELISA方法對培養(yǎng)上清液MCP-1、MIP-2濃度進(jìn)行檢測。 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：數(shù)據(jù)以均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示。應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件，多組間比較采用OneWayANOVE、SNK

13、檢驗(yàn)；方差不齊者首先進(jìn)行數(shù)據(jù)變換，若數(shù)據(jù)變換后仍不齊者多組間多重比較采用多個獨(dú)立樣本非參數(shù)分析Kruskal-Wallis檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水平a=0.05。 結(jié)果： 1.間皮細(xì)胞培養(yǎng)上清中MCP-1，MIP-2的濃度變化：MCP-1、MIP-2的濃度在不同組間存在顯著性差異(F=80.358，P=0.000；F=320.101，P=0.000)。未加LPS組間(1～4組)MCP-1、MIP-2濃度無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，

14、加有LPS的4組中，高濃度燈盞花素組(5組)、中濃度燈盞花素組(6組)與單純LPS組(8組)間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)，而低濃度燈盞花素組(7組)與8組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。 2.間皮細(xì)胞TLR4mRNA表達(dá)檢測：在未加LPS的1～4組中間皮細(xì)胞TLR4mRNA的表達(dá)量相當(dāng)，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(x2=2.544，v=3，P=0.467)；在加有LPS的5～8組中間皮細(xì)胞TLRmRNA的表達(dá)量存在的差異有顯著性意義(x2

15、=25.63，v=3，P=0.000)，8組(未加燈盞花素組)和7組(低濃度燈盞花素組)表達(dá)量相對高，平均秩次分別27.28、27.50，而5組(高濃度燈盞花素組)和6組(中濃度燈盞花素組)表達(dá)量低，平均秩次分別為9.56、9.67，可以認(rèn)為不同濃度燈盞花素對TLR4mRNA的表達(dá)量的影響不同。 結(jié)論： 1.MCP-1、MIP-2對于TLR4具有依賴性，證明了TLR4信號通路的存在的。 2.燈盞花素具有下調(diào)腹膜間

16、皮細(xì)胞TLR4mRNA及信號通路表達(dá)的作用。 全文結(jié)論：本研究通過在尿毒癥大鼠腹膜透析模型基礎(chǔ)上進(jìn)一步建立尿毒癥大鼠腹膜透析UFF模型以及間皮細(xì)胞培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)研究，證明TLR4及其信號傳導(dǎo)在腹膜透析腹膜發(fā)生纖維化(即腹膜超濾失敗)所發(fā)揮的作用。而燈盞花素具有提高腹膜透析效能和保護(hù)腹膜間皮細(xì)胞的作用，其作用機(jī)理與下調(diào)TLR4表達(dá)，降低MCP-1、MIP-2的含量有關(guān)，為其臨床推廣應(yīng)用于治療腹膜透析失超濾提供了較為全面、深入的分子水平