1、近年來，隨著艾滋病的廣泛傳播，癌癥的放療、化療，器官移植后免疫抑制劑的使用，廣譜抗生素的大量使用，以及導(dǎo)管等越來越多的生物材料應(yīng)用于人體，真菌感染率的不斷增加，尤其以白念珠菌的感染最為普遍。全球很多中心檢測統(tǒng)計(jì)資料表明，1996至2002年期間，在系統(tǒng)性真菌感染病例中，白念珠菌感染占50％-60％。由于長期廣泛地預(yù)防性和治療性使用唑類抗真菌藥物(如氟康唑)，白念珠菌的耐藥現(xiàn)象越來越普遍，耐藥程度也越來越高，日益嚴(yán)重的耐藥現(xiàn)象和有限的治療

2、藥物使白念珠菌感染成為臨床上迫切需要解決的問題。 黃芩素(黃芩苷元，Baicalein，BE)是從唇形科植物黃芩的干燥根中提取的有效成份之一。黃芩是常用中藥，其味苦、性寒，歸肺、心、肝、膽、大腸經(jīng)，具有清熱燥濕、瀉火解毒、止血安胎等功效。黃芩素具有抗氧化、抗炎、抗菌、抗腫瘤、抗病毒等藥理活性，且對血液細(xì)胞及肝臟細(xì)胞等正常細(xì)胞無毒性。雖然有研究報(bào)道黃芩素具有抗真菌活性，但由于其活性較弱，一直未應(yīng)用于臨床。鑒于目前白念珠菌普遍的多藥

3、耐藥現(xiàn)象，本課題從聯(lián)合用藥角度出發(fā)，探索治療白念珠菌感染的新策略。 本課題首先采用微量液基稀釋法考察黃芩素對白念珠菌的抑制作用，并以棋盤式微量稀釋法測定黃芩素與氟康唑合用對白念珠菌的抑制作用。其結(jié)果顯示：黃芩素單獨(dú)使用時(shí)對敏感型白念珠菌具有抑制作用，其有效抗菌濃度為1μg/ml-2μg/ml，但對氟康唑耐藥的白念珠菌無效。黃芩素與氟康唑合用于敏感型白念珠菌時(shí)，氟康唑的MIC80值在合用后均有降低，黃芩素的MIC80值在合用后有5

4、0％菌株呈現(xiàn)降低，但所有受試菌株的FIC指數(shù)均＞0.5，兩藥相互作用表現(xiàn)為無關(guān)。在對氟康唑耐藥的白念珠菌中，氟康唑與BE合用顯示出顯著的協(xié)同作用，原本對氟康唑耐藥(MIC80≥64μg/ml)的菌株變得敏感，合用BE后氟康唑的MIC80值降低了32至1028倍，MIC80值分別在＜0.125至2μg/ml之間；BE的MIC80值也明顯下降，受試菌株的FIC指數(shù)位于0.037-0.098之間，兩藥相互作用表現(xiàn)為協(xié)同。 應(yīng)用Time

5、-kill curves實(shí)驗(yàn)對臨床耐藥白念珠菌0603433進(jìn)一步驗(yàn)證氟康唑與黃芩素合用的協(xié)同作用。菌液起始濃度選用體外藥敏實(shí)驗(yàn)的1～5×103CFU/ml和時(shí)間一殺菌曲線常用的1～5×105CFU/ml。當(dāng)菌液起始濃度為1～5×103CFU/ml時(shí)，藥物作用24h后，16μg/ml黃芩素單用對生長曲線沒有影響，未見抗菌作用，其曲線與對照組生長曲線幾乎重合。10μg/ml氟康唑顯示較弱的抑菌作用，合用16μg/ml黃芩素24h后則大大增

6、強(qiáng)了抑菌效果，表明兩藥合用具有協(xié)同抑菌作用。當(dāng)菌液起始濃度為1～5×105CFU/ml時(shí)，單用16μg/ml黃芩素或單用10μg/ml氟康唑?qū)ιL曲線都沒有明顯的抑制作用，兩藥合用24h后，菌濃度比單用氟康唑明顯下降。 在對氟康唑耐藥的白念珠菌中，以棋盤式微量稀釋實(shí)驗(yàn)考察了BE與咪康唑、酮康唑的抗真菌相互作用。結(jié)果表明，咪康唑和酮康唑與BE合用均具有顯著協(xié)同作用，合用BE后兩者的MIC80值全部降到0.5μg/ml以下，F(xiàn)IC指

7、數(shù)均＜0.5，兩藥相互作用表現(xiàn)為協(xié)同。另外，BE與兩性霉素B(Amphotericin B，AmB)合用具有協(xié)同抗真菌的作用。合用BE后兩性霉素B的MIC值由1.2μg/ml降到0.062以下，明顯提高了兩性霉素B的殺菌作用。但對于近平滑念珠菌和光滑念珠菌中，黃芩素與氟康唑合用FIC值均在1.5以上，表現(xiàn)為相互作用無關(guān)。 為了比較正常的與經(jīng)黃芩素處理的白念珠菌生物被膜形態(tài)差異，以FUN-1和ConA染色后，激光共聚焦顯微鏡觀察顯

8、示：正常生物被膜中含有大量菌絲，經(jīng)8μg/ml黃芩素處理的生物被膜明顯受到抑制，結(jié)構(gòu)疏松，菌絲成分明顯減少，極易從附著物上脫落。將不同濃度的黃芩素處理白念珠菌，48小時(shí)后XTT法測定生物被膜的生長動(dòng)力學(xué)，結(jié)果表明，4μg/ml至32μg/ml的黃芩素可對白念珠菌生物被膜的抑制率達(dá)70％，2μg/ml的黃芩素對白念珠菌生物被膜的抑制率為15％，1μg/ml的黃芩素對白念珠菌生物被膜生長幾乎無抑制作用。 刮取經(jīng)不同濃度的黃芩素處理的

9、自念珠菌，測定CSH值，結(jié)果可見，在黃芩素濃度為32μg/ml時(shí)，白念珠菌的CSH值最小，為0.11，隨著BE濃度的降低，CSH值逐漸增大，呈現(xiàn)出劑量依賴性，經(jīng)1μg/ml BE處理的白念珠菌CSH值為0.85。采用實(shí)時(shí)定量RT-PCR法測定白念珠菌CSH相關(guān)基因CSH1的mRNA表達(dá)水平，結(jié)果表明，與對照組相比，經(jīng)黃芩素處理的白念珠菌CSH1 mRNA表達(dá)水平明顯下降。 將不同濃度的黃芩素處理白念珠菌SC5314，12h后以流

10、式細(xì)胞儀測定細(xì)胞凋亡率，同時(shí)采用已知真菌細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)藥物兩性霉素B(AmB)作為陽性對照。結(jié)果顯示，與空白對照組相比，黃芩素可明顯誘導(dǎo)白念珠菌細(xì)胞凋亡，4μg/ml、8μg/ml黃芩素分別可誘導(dǎo)10％及20％的細(xì)胞凋亡。DAPI染色進(jìn)一步確證了白念珠菌細(xì)胞凋亡的發(fā)生。應(yīng)用透射電鏡技術(shù)觀察8μg/ml黃芩素作用于白念珠菌后細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化。在白念珠菌的正常細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)中，細(xì)胞形狀規(guī)則，細(xì)胞膜和細(xì)胞壁完整、光滑、邊界清晰可見，胞核形完整，

11、染色質(zhì)均勻分布。經(jīng)8μg/ml黃芩素處理的白念珠菌細(xì)胞核異常，染色質(zhì)固縮，向核四周凝集，細(xì)胞質(zhì)中有空泡產(chǎn)生，另外分裂細(xì)胞多處于兩細(xì)胞粘連狀態(tài)。 另外，黃芩素對白念珠菌細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)生的促進(jìn)作用具有劑量依賴性，并隨著時(shí)間的延長對ROS產(chǎn)生的促進(jìn)作用也隨之增強(qiáng)。32μg/ml黃芩素處理48h后ROS產(chǎn)生量是對照組的5倍。將16μg/ml的黃芩素處理白念珠菌SC5314，于不同時(shí)間點(diǎn)測定線粒體膜電位，同時(shí)以兩性霉素B作為陽性對照。結(jié)果

12、顯示，與空白對照組相比，黃芩素可明顯降低白念珠菌線粒體膜電位，經(jīng)黃芩素處理12h的白念珠菌線粒體膜電位下降至未經(jīng)處理組一半值。經(jīng)32μg/ml黃芩素作用3h后，CAP1、SOD2及TRR1的mRNA表達(dá)水平明顯上調(diào)，尤其是CAP1基因上調(diào)了近24倍，SOD2和TRR1基因的表達(dá)也分別上調(diào)了3倍和9倍。由于黃芩素可誘導(dǎo)白念珠菌氧化應(yīng)激相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子CAP1的mRNA高表達(dá)，本實(shí)驗(yàn)考察黃芩素對野生型菌(CAF2-1)、CAP1基因敲除菌(CJ