1、目的：探討丹皮酚(Paeonol,Pae)與氟康唑(Fluconazole,FLC)單獨(dú)和聯(lián)合應(yīng)用抗白念珠菌作用及其機(jī)制。
　　方法：1.參照體外藥物敏感試驗(yàn)M27-A3方案：⑴通過微量稀釋法，檢測丹皮酚與氟康唑抗白念珠菌的作用，獲得各藥物單獨(dú)抗菌時的最低抑菌濃度(Minimal inhibitory concentrations,MIC)；⑵通過棋盤格法，檢測丹皮酚和氟康唑聯(lián)合時抗白念珠菌的作用，同時獲得單藥的MIC聯(lián)（藥物聯(lián)合

2、時，單藥的抑菌濃度）及測定部分抑菌濃度(Fractional inhibitory concentration, FIC)及FIC指數(shù)(FIC index, FICI)。2.藥物單獨(dú)及其聯(lián)合作用于白念珠菌：實(shí)驗(yàn)組分為：1：對照組；2：丹皮酚400μg/mL；3：氟康唑1μg/mL；4：丹皮酚1600μg/mL；5：氟康唑4μg/mL；6：丹皮酚400μg/mL與氟康唑1μg/mL。⑴參照血清芽管形成試驗(yàn)的方法，觀察白念珠菌的芽管形成數(shù)量

3、，檢測藥物單獨(dú)及其聯(lián)合對白念珠菌芽管形成的影響。⑵參照白念珠菌對人口腔頰粘膜上皮細(xì)胞(Buccal epithelial cells, BEC)粘附試驗(yàn)方法，觀察各組藥作用后的白念珠菌對上皮細(xì)胞的粘附率，檢測藥物對白念珠菌粘附人口腔粘膜上皮細(xì)胞的影響。⑶采用牛血清白蛋白瓊脂培養(yǎng)基、卵黃培養(yǎng)基，檢測藥物對白念珠菌的分泌型天冬氨酸蛋白酶與細(xì)胞外磷脂酶活性的影響。⑷通過逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Reverse Transcription Poly

4、merase Chain Reaction,RT-PCR)技術(shù)及凝膠分析軟件bandscan5.0，檢測各藥物組對白念珠菌的SAP2與PLB1兩基因的mRNA表達(dá)影響。
　　結(jié)果：1.在pH4.0~6.0的RPMI1640培養(yǎng)基、白念珠菌濃度為5.0×103 CFU/mL的條件下：⑴丹皮酚對白念珠菌的MIC值為1600μg/mL；氟康唑?qū)Π啄钪榫腗IC值為4μg/mL；⑵藥物聯(lián)合時，測得藥物聯(lián)合MIC：丹皮酚(MIC聯(lián)=400μ

5、g/mL)與氟康唑(MIC聯(lián)=1μg/mL)聯(lián)合時FICI=0.5。2.藥物分別與白念珠菌單獨(dú)或聯(lián)合作用后：⑴各組的芽管生成率分別為63.83％、58.33%、51.17%、45.83%、41.33%和39.17%，低于對照組(P<0.05)；且藥物聯(lián)合組的芽管生成率均低于藥物單用組(P<0.05)。⑵各實(shí)驗(yàn)組的白念珠菌對口腔上皮細(xì)胞粘附率分別為100%、96.67%、91.67%、73.00%、65.33%和38.33%，低于對照組(

6、P<0.05或P<0.01)；且藥物聯(lián)合組的粘附率均低于藥物單用組(P<0.05)。⑶通過牛血清白蛋白瓊脂培養(yǎng)基檢測處理后的白念珠菌分泌型天冬氨酸酶活力（Pa值）分別為0.280、0.444、0.474、0.648、0.739和0.877(P<0.05)，且藥物聯(lián)合組的SAP酶活力均低于藥物單用組(P<0.05)；通過蛋黃培養(yǎng)基檢測處理后的白念珠菌細(xì)胞外磷脂酶活力（Pz值）分別為0.248、0.440、0.477、0.660、0.780

7、和0.835(P<0.05)，且藥物聯(lián)合組的PLB酶活力均低于藥物單用組(P<0.05)。⑷應(yīng)用各組藥物分別處理的白念珠菌，其總RNA濃度分別為0.523、0.521、0.521、0.521、0.517、0.515μg/μL，總RNA純度分別為1.887、1.862、1.866、1.860、1.845和1.863，各樣本總RNA和純度間比較無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。各樣本所提取的細(xì)胞總RNA電泳，可見28s、15s和5s三條帶，提示

8、RNA完整性較好。①通過RT-PCR技術(shù)比較，各實(shí)驗(yàn)組白念珠菌的SAP2基因在mRNA的相對表達(dá)量水平分別為0.964、0.911、0.866、0.572、0.491和0.421，低于對照組(P<0.05)，且藥物聯(lián)合組均低于藥物單用組(P<0.05)。②通過RT-PCR技術(shù)比較，各實(shí)驗(yàn)組白念珠菌的PLB1基因在mRNA的相對表達(dá)量水平分別為：0.961、0.898、0.834、0.552、0.479和0.412，低于對照組(P<0.0

9、5)，且藥物聯(lián)合組均低于藥物單用組(P<0.05)。
　　結(jié)論：1.丹皮酚和氟康唑單獨(dú)作用于白念珠菌時，具有明顯的生長抑制作用；兩藥物聯(lián)合時，F(xiàn)ICI=0.5，單藥的MIC明顯降低，且兩種藥物聯(lián)合時具有協(xié)同作用，能顯著抑制白念珠菌的生長。2.藥物聯(lián)合抗白念珠菌時，比藥物單用的抑制作用好，其作用機(jī)制表現(xiàn)為：①藥物聯(lián)合應(yīng)用時，白念珠菌芽管形成能力及對口腔粘膜上皮細(xì)胞的粘附能力均明顯低于各藥物單用組；②白念珠菌分泌型天冬氨酸蛋白酶與細(xì)胞