1、近年來，侵襲性真菌感染在一些免疫力低下者的人群（如腫瘤患者，器官移植、導管插管患者及艾滋病患者等）中的發(fā)生率越來越高。這些臨床分離的侵襲性真菌中，念珠菌占有較高的比例，其中白色念珠菌引起的感染是念珠菌感染的主要組成部分。唑類抗真菌藥物尤其是氟康唑，憑借其安全、有效、價廉和低毒的特性成為預防和治療白色念珠菌所引起感染的首選藥。然而，隨著氟康唑在臨床治療中的頻繁使用，真菌的耐藥現象也隨之而來，給臨床治療深部真菌感染帶來極大的挑戰(zhàn)。
　

2、　研究一個新的抗菌藥物需要巨大的經濟投入，強大的研究隊伍，而且將會耗時多年，因此，聯合用藥成為克服真菌耐藥的有效策略之一。近年來研究表明，許多非抗真菌藥物自身雖無強大的抗真菌作用，但能明顯增加唑類藥物的敏感性，這對于克服真菌耐藥性無疑是一種有效的途徑，也為新藥開發(fā)提供了新的線索與思路。唑類抗真菌藥物在臨床上治療深部侵襲性真菌病的應用非常廣泛，如果能通過聯合用藥的途徑，從已用于臨床的非抗真菌藥物中篩選出能夠增加唑類抗真菌藥物敏感性的有效藥

3、物，這對于增加唑類這一安全、價廉的抗真菌藥物的臨床作用效果，意義重大。
　　鈣穩(wěn)態(tài)是白色念珠菌正常生長的基礎，鈣離子不僅參與胞內基礎代謝，還能維持內質網、高爾基體等重要細胞器的生理功能，而且鈣離子還可作為一種多功能信號載體調節(jié)白色念珠菌細胞的多種活動，包括形態(tài)發(fā)生、環(huán)境壓力應答以及致病性等。鈣通道阻滯劑(Calcium channel blockers，CCBs)為臨床常用藥物，安全性好，近年來許多研究表明多種鈣通道阻滯劑單用或與

4、唑類抗真菌藥物聯合應用均有明顯抗白色念珠菌作用，如硝苯地平和維拉帕米單用能夠抑制白念芽管形成，維拉帕米，硝苯地平和尼莫地平能增強酮康唑抗真菌作用，維拉帕米與氟康唑聯用在對抗白色念珠菌生物被膜方面也具有協(xié)同作用。由此可見，鈣通道阻滯劑在抗真菌領域有著廣泛的應用前景，若能進一步將其抗真菌機制研究透徹，必然會為發(fā)展新的抗真菌方法提供重要思路。此外，我們觀察到，目前國內外圍繞鈣通道阻滯劑的抗真菌實驗研究雖然較多，但是對臨床常用的這幾種該通道阻滯

5、藥如氨氯地平，硝苯地平，貝尼地平和氟桂利嗪與氟康唑聯合抗真菌的作用卻沒有研究。本實驗選取臨床常用的這四種鈣通道阻滯劑，觀察其與氟康唑的聯合抗白色念珠菌作用，發(fā)現該組合表現出強烈協(xié)同作用，因此又對兩類藥物的協(xié)同作用機制進行了深入的探討與研究。若能將鈣通道阻滯劑與氟康唑藥物的協(xié)同抗耐藥白色念珠菌機制研究透徹，不僅能擴大鈣通道阻滯劑的臨床應用范圍，還將對抗真菌耐藥的研究產生重大的理論依據與現實意義。
　　1.氟康唑和鈣通道阻滯劑聯合抗白

6、念的作用研究
　　參照CLSI M27-A3方案中的棋盤法，用對倍稀釋的方法配制系列濃度的鈣通道阻滯劑（氨氯地平，硝苯地平，貝尼地平和氟桂利嗪）和氟康唑。分別吸取50微升的氟康唑和鈣通道阻滯劑類藥物加入96孔板各個孔內，再往各含藥孔中分別加入提前配好的終濃度約為1×103 CFU/ml的白念，在35度恒溫培養(yǎng)箱內靜置培養(yǎng)24h，用XTT-甲萘醌避光負載2h，用酶標儀測OD值，以真菌生長達到80％抑制時為判讀終點，用分數抑菌濃度指數

7、(FICI)法和非參數反應面(△E)法分別評價藥物聯用結果。結果顯示氨氯地平，硝苯地平，貝尼地平和氟桂利嗪與氟康唑聯用對耐藥白念的FICI分別為0.017，0.019，0.035和0.033，均遠遠小于0.5，正負△E值相加之和遠大于200％，證明這兩類藥物聯合對耐藥白念的顯著協(xié)同作用。但對敏感白念無協(xié)同作用。
　　于不同的EP管中分別加入CA10菌懸液，并加入一定濃度的不同藥物及組合，以XTT法分別測定不同時間點藥物作用的效果。

8、以時間為橫坐標，以所測OD值為縱坐標，繪制不同藥物組合對CA10的時間殺菌曲線圖。結果發(fā)現，與生長對照組相比，6h之后各含氟康唑的組開始出現生長延遲，其中氟康唑和氨氯地平聯用組處理的真菌生長延遲最明顯，再次驗證了氨氯地平，硝苯地平，貝尼地平和氟桂利嗪與氟康唑的聯合抗耐藥白色念珠菌的協(xié)同作用。
　　2.氟康唑和鈣通道阻滯劑聯用對真菌細胞內鈣濃度的影響
　　選取體外作用研究中與氟康唑協(xié)同效果最好鈣通道阻滯劑氨氯地平為主要受試藥。

9、于10ml無菌離心管中過夜培養(yǎng)一定濃度的CA10菌液，離心收集菌細胞，用不含鈣的D-Hanks緩沖液清洗三次，再用D-Hanks緩沖液重懸，濾過分散細胞（300目尼龍網），調節(jié)菌液濃度為1×107 CFU/ml，將調節(jié)后的菌液與終濃度為6μM的Fluo-3/AM在37℃下120rpm振蕩，避光負載50min，加入氨氯地平和氟康唑的單藥或組合藥后上機用流式細胞儀測各組胞內熒光強度，來反映細胞內鈣濃度。
　　結果表明，和生長對照組相比

10、，氨氯地平或氟康唑單用組中CA10細胞內鈣離子幾乎無變化，兩種藥物聯用組中CA10細胞內鈣離子濃度則有升高趨勢。由此可以推測，兩藥聯用對抗耐藥白色念珠菌的協(xié)同機制可能與真菌細胞內鈣離子紊亂有關。
　　3.氟康唑和鈣通道阻滯劑聯用對白色念珠菌細胞內鈣通道相關基因表達的影響
　　為進一步探討和研究兩藥聯用導致CA10細胞內鈣濃度升高的原因，本實驗仍是以鈣通道阻滯劑中的氨氯地平與氟康唑作為受試藥，用熱酚法提取兩藥單用或聯用處理后C

11、A10的總RNA，并設置不加藥的對照組。分別采用普通反轉錄PCR(reverse transcription PCR)和實時定量PCR(Real Time-PCR，RT-PCR)的方法對鈣信號通路中編碼細胞膜上鈣通道的基因（CCH1，MID1），編碼鈣調磷酸酶的基因(CNA1，CNB1)和編碼液泡膜上介導細胞內高濃度鈣進入液泡內的鈣通道基因（YVC1）的表達量進行測定。結果表明，與對照組和單用組相比，兩藥聯用組對CCH1和MID1的表達

12、量無明顯影響，卻驚喜的發(fā)現聯用組和能引起CNA1，CNB1和YVC1基因表達量的降低，尤其是CNA1的基因表達量，降低量最為明顯。由此我們可以推測，氨氯地平和氟康唑聯合的協(xié)同作用機制可能與抑制了CNA1，CNB1，YVC1基因的表達有關。從而引起對鈣離子平衡調控起著重要作用的鈣調磷酸酶的功能和介導細胞內高濃度鈣進入液泡的鈣通道受抑，導致CA10細胞內鈣濃度的升高。
　　4.鈣通道阻滯劑對氟康唑的耐藥基因及蛋白的表達和功能的影響

13、r>　　由于藥物外排增加是白色念珠菌最常見的耐藥機制之一，本實驗分別利用PCR技術和羅丹明6G外排實驗從基因表達水平的變化和蛋白活性的變化兩個角度探究鈣通道阻滯劑氨氯地平等是否減弱了耐藥真菌對氟康唑的外排。通過熱酚法提取CA10的總RNA，反轉錄成cDNA，用普通PCR和RT-PCR定性和定量測定的外排耐藥基因CDR1，CDR2和MDR1的表達變化。并利用羅丹明6G作為藥物外排的底物，探究鈣通道阻滯劑的加入是否抑制了真菌外排泵的活性。實

14、驗結果發(fā)現，與對照組相比，氨氯地平和氟康唑單用或聯用對CDR1，CDR2和MDR1表達量的影響均無顯著差異。且羅丹明6G實驗表明鈣通道阻滯劑的加入并不能影響藥物的外排泵的活性。由此我們推測，鈣通道阻滯劑和氟康唑聯合協(xié)同作用機制與減弱藥物外排無關。
　　綜上所有實驗證明，氨氯地平，硝苯地平，貝尼地平和氟桂利嗪和氟康唑聯合抗白色念珠菌具有強協(xié)同作用。協(xié)同作用機制可能與抑制了真菌細胞內編碼鈣調磷酸酶的基因（CNA1，CNB1）和編碼液泡