1、研究背景：
　　 新生兒缺氧缺血性腦損傷(hypoxic—ischemic brain damage，HIBD)是引起新生兒急性死亡和慢性神經(jīng)系統(tǒng)損傷的主要原因，嚴(yán)重危害新生兒健康，病情重，病死率和致殘率高。隨著新生兒科搶救水平及生命支持技術(shù)的提高，早產(chǎn)兒、嚴(yán)重窒息兒和各種腦損傷兒存活率大大提高，使得新生兒缺氧缺血性腦病(hypoxic—ischemic encephalopathy，HIE)的患病率不僅沒有減少，反而有升高的趨

2、勢，已成為導(dǎo)致兒童殘疾的主要疾病之一，嚴(yán)重影響小兒身心發(fā)育和生活質(zhì)量，也給個(gè)人、家庭和社會帶來了極大的精神痛苦和沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。傳統(tǒng)的治療方法如藥物治療、高壓氧治療等都僅局限于支持治療，只能在一定程度上緩解癥狀，難以促進(jìn)神經(jīng)再生進(jìn)而從根本上恢復(fù)神經(jīng)系統(tǒng)的功能。
　　 干細(xì)胞尤其是神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cells，NSCs)的發(fā)現(xiàn)給HIE患者帶來了新的希望。大量的研究已經(jīng)證實(shí)，神經(jīng)干細(xì)胞由于具有自我更新和多向分化的潛

3、能而成為修復(fù)神經(jīng)系統(tǒng)損傷的理想材料。NSCs研究成為目前生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)，而NSCs移植為治療神經(jīng)系統(tǒng)損傷提供了新的方向。目前對NSCs的應(yīng)用研究主要集中在以下兩個(gè)方面：一是將在體外分離培養(yǎng)并大量擴(kuò)增的NSCs直接移植到神經(jīng)系統(tǒng)損傷部位，從而起到修復(fù)作用；二是將NSCs作為載體，將有治療作用的特定基因克隆到NSCs而制作基因工程神經(jīng)干細(xì)胞，通過移植達(dá)到細(xì)胞替代和基因治療的雙重功效。
　　 研究表明胰島素樣生長因子1(Ins

4、ulin—like growth factor—1，IGF—1)不僅對大腦生長、發(fā)育、髓鞘的形成有重要的作用，而且是潛在的有絲分裂源，能夠在體外誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、分化及調(diào)節(jié)細(xì)胞存活，同時(shí)體內(nèi)外多種創(chuàng)傷模型也顯示了其重要的神經(jīng)營養(yǎng)及神經(jīng)保護(hù)作用。有研究發(fā)現(xiàn)，腦損傷后立即給予IGF—1可明顯減少神經(jīng)元死亡，能有效改善腦損傷引起的不良后果。
　　 既往的研究顯示，單獨(dú)移植NSCs或IGF—1均能對HIBD動物模型發(fā)揮重

5、要的治療作用，促進(jìn)神經(jīng)功能的恢復(fù)。但將二者聯(lián)合，選擇IGF—1對NSCs進(jìn)行基因修飾構(gòu)造基因工程神經(jīng)干細(xì)胞，通過細(xì)胞移植探討對HIBD的治療研究還未見報(bào)道。本課題旨在尋求新的NSCs來源，構(gòu)造基因工程修飾神經(jīng)干細(xì)胞NSCs—IGF—1，通過對移植NSCs—IGF—1的HIBD大鼠的觀察，來探討基因工程修飾神經(jīng)干細(xì)胞NSCs—IGF—1治療HIBD的可行性，為臨床應(yīng)用NSCs—IGF—1治療HIBD奠定理論基礎(chǔ)。
　　 目的：

6、r>　　 1．研究人臍帶血來源的神經(jīng)干細(xì)胞體外分離、培養(yǎng)、誘導(dǎo)分化及鑒定的方法，觀察神經(jīng)干細(xì)胞增殖、傳代和分化規(guī)律，建立合適的體外穩(wěn)定培養(yǎng)體系。
　　 2．構(gòu)建IGF—1真核表達(dá)載體pcDNA3．1—IGF—1，并轉(zhuǎn)染NSCs以建立基因工程神經(jīng)干細(xì)胞NSCs—IGF—1，為HIBD的治療打下基礎(chǔ)。
　　 3．探討基因工程神經(jīng)干細(xì)胞NSCs—IGF—1移植對HIBD新生鼠腦部結(jié)構(gòu)和功能重建的影響，為臨床應(yīng)用基因工程神經(jīng)干

7、細(xì)胞移植治療HIBD提供理論支持。
　　 方法：
　　 1．無菌條件下取健康育齡產(chǎn)婦正常足月分娩胎兒臍帶血，肝素抗凝，等體積磷酸鹽緩沖液(PBS)稀釋后，密度梯度離心法分離其中單個(gè)核細(xì)胞。臺盼藍(lán)拒染法計(jì)數(shù)活細(xì)胞，以1×106/mL密度將臍血單個(gè)核細(xì)胞接種到培養(yǎng)瓶，加入含有B27、EGF和bFGF的無血清DMEM/F12培養(yǎng)基，37℃、5％CO2條件下培養(yǎng)細(xì)胞，3天后半量換液。待細(xì)胞培養(yǎng)至第7天，離心收集神經(jīng)球，使用胰蛋白

8、酶消化法和機(jī)械法相結(jié)合的方法進(jìn)行傳代，以5×105/mL將傳代后的神經(jīng)干細(xì)胞接種于新培養(yǎng)瓶，置37℃、5％CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)。P3代神經(jīng)干細(xì)胞加入含20％胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液，進(jìn)行誘導(dǎo)分化。倒置顯微鏡動態(tài)觀察細(xì)胞生長狀況。
　　 2．加入5—溴脫氧尿嘧啶(BrdU)20μmol/L對P3代臍血神經(jīng)干細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記。在37℃、5％CO2條件下培養(yǎng)3天后行免疫熒光化學(xué)染色檢測BrdU陽性細(xì)胞，對細(xì)胞的增殖能力進(jìn)行鑒定。同

9、時(shí)對分化前后的P3代神經(jīng)干細(xì)胞分別進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色檢測Nestin、NSE、GFAP和MBP的表達(dá)，對神經(jīng)干細(xì)胞及其分化細(xì)胞進(jìn)行鑒定。另外，對分化前的P3代臍血神經(jīng)干細(xì)胞進(jìn)行G418最佳篩選濃度的測定。
　　 3．從胎肝抽提總RNA，利用RT—PCR獲得目的基因IGF—1。將目的基因于1％瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳，割膠回收目的基因片段。將該目的基因與質(zhì)粒pcDNA3．1進(jìn)行連接構(gòu)建IGF—1的真核表達(dá)重組質(zhì)粒pcDNA3．1—I

10、GF—1。用氯化鈣法制備DH5a大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，將連接液加入細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)化，次日挑取氨芐青霉素抗性菌落進(jìn)行擴(kuò)增，小量制備重組質(zhì)粒DNA。BamHⅠHindⅢ雙酶切對重組質(zhì)粒進(jìn)行鑒定，同時(shí)將酶切正確的菌液進(jìn)行測序鑒定。
　　 4．搖菌擴(kuò)增含有目的基因的重組質(zhì)粒，用SDS裂解法進(jìn)行大量抽提。應(yīng)用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將重組質(zhì)粒pcDNA3．1—IGF—1轉(zhuǎn)染P3代臍血神經(jīng)干細(xì)胞，同時(shí)設(shè)立空質(zhì)粒組和未轉(zhuǎn)染對照組。G418篩選抗藥性克隆進(jìn)行擴(kuò)大

11、培養(yǎng)。并用RT—PCR檢測IGF—1基因在基因轉(zhuǎn)染神經(jīng)干細(xì)胞中的表達(dá)，將產(chǎn)物經(jīng)2％瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定。免疫熒光細(xì)胞化學(xué)法檢測轉(zhuǎn)染細(xì)胞內(nèi)IGF—1與Nestin的表達(dá)，對轉(zhuǎn)染效果進(jìn)行鑒定。以含20％胎牛血清的新鮮DMEM/F12培養(yǎng)基誘導(dǎo)后，免疫熒光細(xì)胞化學(xué)法檢測NSE，GFAP和MBP在轉(zhuǎn)染細(xì)胞中的表達(dá)，對轉(zhuǎn)基因神經(jīng)干細(xì)胞的分化能力進(jìn)行鑒定。
　　 5．將80只SD大鼠通過結(jié)扎左頸總動脈，低氧箱中缺氧處理的方法，構(gòu)建新生大鼠

12、HIBD模型，將造模后存活的75只大鼠隨機(jī)分成三組：模型對照組，NSCs移植組和NSCs—IGF—1移植組，每組25只。每組再進(jìn)一步隨機(jī)分為1d組、7d組、14d組、21d組及肢體運(yùn)動功能檢測組，每組5只。移植前3d，將基因工程神經(jīng)干細(xì)胞NSCs—IGF—1和未轉(zhuǎn)染神經(jīng)干細(xì)胞進(jìn)行BrdU標(biāo)記(終濃度1μmol/L)。動物模型制備24h后按1．0 mL/100g體重(細(xì)胞濃度為1×106/mL)行尾靜脈注入法進(jìn)行細(xì)胞移植。取25只正常SD

13、大鼠作為正常對照組，不進(jìn)行模型制作，不移植任何細(xì)胞； NSCs—IGF—1移植組為HIBD模型大鼠經(jīng)尾靜脈移植基因工程神經(jīng)干細(xì)胞NSCs—IGF—1；NSCs移植組于相同部位注入等量神經(jīng)干細(xì)胞；模型對照組為HIBD大鼠注入等量生理鹽水。
　　 6．各組動物每組5只分別在移植術(shù)后1d、7d、14d、21d處死，免疫熒光檢測BrdU表達(dá)情況，對移植細(xì)胞在腦內(nèi)的存活情況進(jìn)行檢測。通過Nestin、NSE、GFAP免疫細(xì)胞化學(xué)染色觀察神

14、經(jīng)干細(xì)胞增殖、分化及在大鼠腦內(nèi)分布情況，并通過Y—迷宮試驗(yàn)和運(yùn)動功能檢測對大鼠腦功能恢復(fù)情況進(jìn)行觀察研究。
　　 結(jié)果：
　　 1．原代培養(yǎng)的NSCs在無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)7d左右可形成大量懸浮的神經(jīng)球，用胰蛋白酶消化法和機(jī)械法相結(jié)合的方法傳代后，細(xì)胞呈散在懸浮狀態(tài)，37℃5％CO2條件下培養(yǎng)3—5d后，又可見中等大小神經(jīng)球出現(xiàn)在培養(yǎng)基中。隨著傳代的次數(shù)增加，細(xì)胞增殖速度逐漸減慢。P3代神經(jīng)干細(xì)胞經(jīng)過20％胎牛血清誘導(dǎo)培養(yǎng)

15、1d后可見培養(yǎng)細(xì)胞開始貼壁，邊緣出現(xiàn)細(xì)的突起；誘導(dǎo)分化第3d，貼壁細(xì)胞可見突起生長；誘導(dǎo)分化第7d，可以觀察到神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞。
　　 2．P3代臍血神經(jīng)干細(xì)胞進(jìn)行BrdU標(biāo)記后，熒光顯微鏡下可觀察到大量BrdU表達(dá)陽性細(xì)胞。免疫細(xì)胞化學(xué)檢測顯示，原代及傳代培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞Nestin表達(dá)呈陽性，而經(jīng)過20％胎牛血清誘導(dǎo)培養(yǎng)7d后未見Nestin表達(dá)陽性的細(xì)胞，可見NSE，GFAP和MBP陽性細(xì)胞。同時(shí)，G41

16、8對P3代臍血神經(jīng)干細(xì)胞最佳篩選濃度為400ug/mL。
　　 3．胎肝總RNA經(jīng)RT—PCR后產(chǎn)物電泳顯示在462bp處出現(xiàn)目的條帶，目的基因IGF—1與質(zhì)粒pcDNA3．1連接產(chǎn)物pcDN—A3．1—IGF—1經(jīng)HindⅢ與BamHⅠ雙酶切后，1％瓊脂糖凝膠電泳顯示在5428bp處和462bp處各有一條亮帶，空質(zhì)粒組只在5428bp處有一條亮帶，結(jié)果與質(zhì)粒載體及目的基因大小相符，證明所構(gòu)建的真核表達(dá)載體pcDNA3．1—IG

17、F—1大小及方向正確。對該重組體進(jìn)行測序發(fā)現(xiàn)目的基因符合genebank序列(Nmol/L—000618)，表明真核表達(dá)載體pcDNA3．1—IGF—1成功構(gòu)建。
　　 4．重組質(zhì)粒pcDNA3．1—IGF—1轉(zhuǎn)染神經(jīng)干細(xì)胞后，加入含400ug/mL G418的篩選液篩選兩天后細(xì)胞開始死亡，一周后死亡細(xì)胞達(dá)高峰，之后細(xì)胞死亡漸漸減少，并且開始分裂增殖，2周后逐漸出現(xiàn)抗G418的陽性克隆，但未轉(zhuǎn)染細(xì)胞逐漸在含G418的篩選液中全部

18、死亡。初步證明IGF—1基因轉(zhuǎn)染神經(jīng)干細(xì)胞成功。收集抗藥性克隆，經(jīng)過RT—PCR檢測可得到一條約462bp的條帶，長度與目的基因相符，證明成功構(gòu)建了基因工程神經(jīng)干細(xì)胞NSCs—IGF—1。對此細(xì)胞行Nestin和IGF—1免疫熒光化學(xué)染色，均顯示陽性，表明IGF—1在轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞中成功表達(dá)，且神經(jīng)干細(xì)胞的未分化狀態(tài)未因IGF—1的表達(dá)而改變。經(jīng)含20％胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基誘導(dǎo)7天后，可見基因轉(zhuǎn)染神經(jīng)干細(xì)胞克隆分化為典型的神經(jīng)

19、元、少突膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞，免疫熒光細(xì)胞化學(xué)法檢測其NSE、GFAP和MBP染色陽性。
　　 5．對SD大鼠通過結(jié)扎左頸總動脈和低氧處理后，發(fā)現(xiàn)大鼠出現(xiàn)右側(cè)肢體癱瘓，證明大鼠HIBD模型建立成功。
　　 6．基因工程神經(jīng)干細(xì)胞NSCs—IGF—1移植HIBD動物模型后，用免疫熒光對BrdU示蹤結(jié)果顯示，NSCs移植組和NSCs—IGF—1移植組均可見到BrdU陽性細(xì)胞，且在觀察時(shí)間內(nèi)隨著細(xì)胞移植時(shí)間延長陽性細(xì)胞不斷增

20、多。靜脈移植的BrdU陽性細(xì)胞可遷移至HIBD大鼠腦內(nèi)并進(jìn)一步趨化至左側(cè)室管膜前下區(qū)(anterior subventricularzone，SVZa)存活下來。移植7d后，NSCs移植組和NSCs—IGF—1移植組間進(jìn)行比較，BrdU陽性率差異顯著(P<0．05)。
　　 7．經(jīng)過HE染色，Nestin、NSE、GFAP免疫組化等方法顯示移植細(xì)胞可趨化至模型動物左側(cè)SVZa區(qū)存活并進(jìn)行分化。在觀測時(shí)間點(diǎn)內(nèi)，NSCs—IGF—1

21、移植組Nestin陽性細(xì)胞表達(dá)量早期升高，移植后14d達(dá)峰，后逐漸下降，NSE陽性細(xì)胞表達(dá)量逐漸升高。而模型對照組在移植7d后Nestin及NSE陽性細(xì)胞表達(dá)量逐漸降低，兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。各組SVZa區(qū)GFAP染色陽性細(xì)胞表達(dá)量總體逐漸升高，其中模型組表達(dá)最高，與NSCs—IGF—1移植組及正常對照組相比均有顯著性差異(P<0．05)，NSCs—IGF—1移植組與正常對照組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0．05)。大鼠學(xué)習(xí)記憶功能檢測及運(yùn)動功能

22、檢測結(jié)果均顯示NSCs—IGF—1移植組明顯優(yōu)于模型對照組，二者差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)論：
　　 1．人臍血可以誘導(dǎo)培養(yǎng)出神經(jīng)干細(xì)胞。
　　 2．脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染方法能夠安全有效地將IGF—1轉(zhuǎn)染神經(jīng)干細(xì)胞。
　　 3．成功構(gòu)建基因工程神經(jīng)干細(xì)胞NSCs—IGF—1，并且細(xì)胞的自我更新及多向分化潛能未因IGF—1基因的轉(zhuǎn)入而改變。
　　 4．基因工程神經(jīng)干細(xì)胞NSCs—IGF—1移植后，細(xì)