1、近年來，真菌感染的發(fā)病率逐年上升。這主要是由于一些醫(yī)療措施的改變，包括廣譜抗生素的濫用、HIV感染、以及癌癥化療和器官移植所引起的免疫抑制等等。特別是持續(xù)性免疫缺陷患者，其真菌感染率很高。真菌感染難以治療，一方面是現有抗真菌藥物品種有限，活性不強且具有毒副作用，另一方面是由于抗真菌藥物在臨床上大量應用，導致真菌耐藥性的迅速發(fā)展，嚴重影響了藥物的治療效果。真菌感染率的不斷增加、致病菌譜的不斷增寬以及耐藥真菌所致感染的臨床嚴重性，促進了真菌

2、耐藥機制的研究和抗真菌活性化合物的篩選。 羽苔素E是由我院天然藥化實驗室從苔蘚類植物地錢中提取的雙聯芐類化合物，初步活性篩選實驗表明具有較好的抗真菌活性。本實驗首先對羽苔素E(Plagiochin E)的抗真菌活性進行了評價，并測定了羽苔素E與氟康唑的聯合抗真菌作用。在此基礎上，觀察了羽苔素E與氟康唑合用對白念珠菌耐藥株的作用。并進一步對羽苔素E逆轉真菌對氟康唑耐藥的機制進行了研究。一、羽苔素E抗真菌作用及與氟康唑的聯合抗真菌作

3、用的研究 羽苔素E體外抗真菌活性的測定是按美國臨床標準化委員會(NCCLS)建立的真菌敏感性測定方案(M27-A)進行的，實驗所用菌株為15株臨床新近分離的白色念珠菌。實驗結果表明，羽苔素E具有中等抗真菌活性，MIC為16μg/ml。在與氟康唑聯合抗菌活性實驗中，氟康唑濃度設為0.03125～4μg/ml，羽苔素E濃度設為0.5～2561μg/ml。聯合抗菌活性以抑菌濃度分數(fractional inhibitedconcen

4、tration，FIC)指數評價。實驗結果表明，羽苔素E與氟康唑合用時能明顯降低氟康唑和羽苔素E的用藥量，顯示出相加的抗真菌作用。二、羽苔素E單用或與氟康唑合用對耐藥株的抗真菌作用的研究 本實驗中共用白念耐藥株四株，其中兩株為臨床分離獲得(QL-14，QL-28)，其MIC值均為128ug/ml，另外兩株由氟康唑體外誘導獲得。 1．白念耐藥株的體外誘導：取兩株白念敏感株(SDEY-24,SDEY-09)，在含氟康 唑

5、16ug/ml的YEPD液體培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)，測定誘導后氟康唑對各代菌株的 MIC值。結果發(fā)現，兩株菌株經不同時間均誘導出耐藥性，但體外傳代所需的 時間不同，菌株SDEY-24和SDEY-09分別于第7代(35d)和第8代(38d)MIC 達64ug/ml，證實已誘導出耐藥性。 2．對耐藥株的抗真菌作用：同樣采用微量稀釋法觀察了羽苔素E單獨應用及與 氟康唑合用對耐藥株的抗真菌作用。實驗結果表明，對氟康唑耐藥株，羽苔素E

6、 單獨應用仍能表現出與敏感株相似的抗真菌作用(MIC為16～32ug/m1)。而與 氟康唑合用，觀察到羽苔素E能明顯降低氟康唑對耐藥株的用量，且羽苔素E 的MIC值也顯著降低，FIC<0.5，二者合用對耐藥株表現出協同的抗真菌作用。 三、羽苔素E逆轉真菌對氟康唑耐藥的機制研究 1．羽苔素E與氟康唑合用對真菌細胞內氟康唑聚集的影響試驗：所用菌株為白 念氟康唑耐藥株．(MIC=128ug/m1)，最終菌懸液濃度是0.6

7、x10<'7>cfu/ml。羽苔素E 的濃度水平設為0.5MIC，2MIC及8MIC，氟康唑濃度設為0.25ug/ml。菌懸液與 氟康唑單獨培養(yǎng)及氟康唑和羽苔素E聯合培養(yǎng)24小時后，離心得到真菌細胞，然后經皂化、提取等過程得到菌體細胞內聚集的氟康唑。氟康唑的測定采用高效 液相與質譜聯用的方法，并選用酮康唑作為內標物。氟康唑定量是通過測定質荷 比為307的分子離子及質荷比為220的碎片離子信號進行的，最低檢測限為 1.0ng/m

8、l，標準曲線線性范圍為1.0-100ng/ml，相關系數為0.9956。通過精密度、回收率的檢測，證實此方法精密、準確，可以用于白念珠菌細胞內的氟康唑濃度 測定。濃度檢測結果顯示，當與氟康唑合用時，羽苔素E能顯著增加耐藥株菌 體細胞內氟康唑的聚集，且細胞內氟康唑的量隨著合用羽苔素E濃度的增加而 增加。這可能是羽苔素E與氟康唑合用對耐藥株呈現協同的抗真菌作用的機制 之一。 2．羽苔素E對若丹明123在耐藥株中蓄積與分布的影

9、響：若丹明123是一種熒 光物質，可通過被動擴散進入細胞內，并且是細胞膜上主動外排系統(tǒng)的底物，可通過檢測菌株對若丹明123的泵出，來反映菌株細胞膜上多藥耐藥蛋白功能的表達情況。實驗所用菌株為氟康唑耐藥株(MIC=128μg/m1)和敏感株(MIC=0.5μg/m1)，并觀察羽苔素E對耐藥株中若丹明123泵出的影響，羽苔素E的濃度水平設為0.5MIC，2MIC及8MIC。菌株在RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，當菌液濃度達到10<'7>

10、cfu/ml時，離心收集細胞，總菌量約為10<'9>cfu。用PBS緩沖液進行沖懸，加入若丹明123(終濃度為10μM)，并加入不同濃度的羽苔素E溶液，35℃振蕩培養(yǎng)，每隔10min取標本1ml，離心收集上清液，上清液用熒光分光光度計測定吸光度。后離心剩余菌懸液，菌體用含5％葡萄糖PBS緩沖液沖懸，35℃振蕩培養(yǎng)，同樣方法取上清液測定吸光度。上清液中若丹明123的濃度通過預先建立的若丹明123的標準曲線來確定。結果顯示，所有菌株在無能量

11、供應時，若丹明123可快速進入細胞內，耐藥株和敏感株對若丹明123的吸收無明顯差異；加入葡萄糖提供能量后，耐藥株外排若丹明123與敏感株相比顯著增加。而羽苔素E對若丹明123的吸收無顯著影響，卻可顯著抑制若丹明123的泵出。應用共聚焦激光掃描顯微鏡進行了形態(tài)學的觀察，結果與熒光分光光度計法檢測一致。上述實驗結果初步提示羽苔素E逆轉氟康唑耐藥的機制可能是通過抑制了主動外排系統(tǒng)的功能。 3．羽苔素E對白念耐藥株細胞膜上主動外排基因CD

12、Rl表達水平(mRNA)的影響：在上述結果的基礎上，采用RT-PCR法檢測羽苔素E對白念耐藥株細胞膜上主動外排基因CDR1表達水平的影響。實驗所用菌株為臨床分離的氟康唑耐藥株(MIC=128μg/ml)、敏感株(MIC=0.5μg/ml)、氟康唑體外誘導獲得耐藥株(MIC=64μg/ml)、臨床分離的耐藥株羽苔素E用藥組(MIC=128μg/ml，羽苔素E濃度128μg/ml)。常規(guī)方法抽提菌株總RNA，根據主動外排泵基因設計特異性PC

13、R引物，擴增主動外排基因CDRl，以actl基因為內參照，RT-PCR檢測各組菌株中主動外排基因的相對表達量。結果顯示，所有菌株均有基因CDRl的表達，耐藥株基因表達量顯著高于敏感株，氟康唑體外誘導獲得的耐藥株其CDRl的表達也明顯增加。羽苔素E128μg/ml能夠明顯抑制耐藥株中CDR1的表達水平。結果提示，主動外排基因的表達增多是白念珠菌對氟康唑耐藥的重要機制之一。羽苔素E能夠明顯抑制耐藥菌株主動外排基因mRNA水平的表達，進一步證

14、實了羽苔素E逆轉氟康唑耐藥的主要機制是通過抑制了耐藥株細胞膜上主動外排系統(tǒng)的表達。 總之，本論文主要評價了天然雙聯芐類化合物一羽苔素E在體外抗白色念珠菌的活性以及與氟康唑的聯合抗真菌作用。并在體外用氟康唑誘導獲得白念耐藥株，觀察了羽苔素E本身及與氟康唑合用對耐藥株的作用，并對羽苔素E逆轉氟康唑耐藥的機制進行研究。采用液一質聯用法測定了白念耐藥株細胞內氟康唑的濃度；建立并采用熒光法和共聚焦激光掃描顯微鏡等方法，研究了羽苔素E對耐