1、目的：妊娠期高血壓疾病是產(chǎn)科最常見(jiàn)的合并癥，在我國(guó)發(fā)病率為9.40％，是導(dǎo)致孕產(chǎn)婦和圍生兒病率及死亡率升高的主要原因。子癇前期和子癇是妊娠期高血壓疾病的嚴(yán)重階段，至今病因和發(fā)病機(jī)理不明，給預(yù)防和治療帶來(lái)困難。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)國(guó)外的專(zhuān)家學(xué)者對(duì)其病因和發(fā)病機(jī)理作了大量的研究工作，提出了許多學(xué)說(shuō)，目前比較公認(rèn)的發(fā)病機(jī)制是免疫學(xué)說(shuō)、胎盤(pán)或滋養(yǎng)葉細(xì)胞缺血學(xué)說(shuō)、遺傳學(xué)說(shuō)、血管活性物質(zhì)學(xué)說(shuō)、鈣平衡失調(diào)學(xué)說(shuō)、血管內(nèi)皮損傷學(xué)說(shuō)，但仍無(wú)一種理論能滿(mǎn)意、全面地解

2、釋其病因?，F(xiàn)又有學(xué)者提出了一種新的理論，炎癥刺激可能參與了妊娠期高血壓疾病的發(fā)病過(guò)程，并且已有學(xué)者用內(nèi)毒素刺激成功地建立了子癇前期的動(dòng)物模型，且抗炎治療有效。說(shuō)明感染可導(dǎo)致母胎免疫平衡失調(diào)，引起免疫損傷，滋養(yǎng)細(xì)胞缺血及胎盤(pán)植入異常，加重胎盤(pán)缺血缺氧，血漿毒性因子釋放，引起全身的血管內(nèi)皮損傷，最終導(dǎo)致子癇前期和子癇。
　　 胎盤(pán)是一個(gè)重要的免疫器官，內(nèi)含大量單核巨噬細(xì)胞，被認(rèn)為是子癇前期患者體內(nèi)“毒性因子”的來(lái)源，胎盤(pán)滋養(yǎng)細(xì)胞的作

3、用頗受關(guān)注。有學(xué)者認(rèn)為妊娠期滋養(yǎng)細(xì)胞也是一種免疫細(xì)胞，是天然免疫系統(tǒng)的組成部分，影響母兒的免疫應(yīng)答。滋養(yǎng)細(xì)胞和巨噬細(xì)胞具有某些共同特性：吞噬、形成合體細(xì)胞、組織浸潤(rùn)功能；表達(dá)CD4、CD14、IgG受體；分泌白介素-1、2和6(IL-1，IL-2，IL-6)，干擾素-γ(INF-γ)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)等多種細(xì)胞因子，并表達(dá)它們的受體。許多學(xué)者的關(guān)注。鈣衛(wèi)蛋白是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一種新的與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)的鈣結(jié)合蛋白，屬于S100

4、蛋白家族的成員，是由S100A8和S100A9構(gòu)成的異二聚體，主要表達(dá)于中性粒細(xì)胞、單核-巨噬細(xì)胞，具有抑制細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、調(diào)節(jié)免疫、參與炎癥反應(yīng)等多種生物學(xué)功能，在許多急慢性炎癥疾病中發(fā)現(xiàn)其表達(dá)升高，有提出鈣衛(wèi)蛋白可以在一定程度上反映炎癥疾病的嚴(yán)重程度。糖基化終末產(chǎn)物受體(RAGE)是鈣衛(wèi)蛋白的受體，可與鈣衛(wèi)蛋白結(jié)合后啟動(dòng)若干信號(hào)通路，介導(dǎo)多種炎癥病理過(guò)程。TNF-α是一種促炎性細(xì)胞因子，在妊娠組織中通過(guò)自分泌或旁分泌作用調(diào)節(jié)

5、局部的子宮活動(dòng)，從而參與許多生理和病理過(guò)程。
　　 目前，鈣衛(wèi)蛋白在子癇前期母血中的表達(dá)國(guó)外僅有少量報(bào)道，國(guó)內(nèi)尚無(wú)報(bào)道。在母血、胎盤(pán)、滋養(yǎng)細(xì)胞中的研究國(guó)內(nèi)外至今無(wú)報(bào)道。為探討鈣衛(wèi)蛋白對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞的致炎作用及妊娠期高血壓疾病的發(fā)病機(jī)制，擬檢測(cè)鈣衛(wèi)蛋白及其受體RAGE和TNF-α在妊娠期高血壓疾病中的表達(dá)，研究鈣衛(wèi)蛋白對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞表達(dá)炎性介質(zhì)的誘導(dǎo)作用及NF-κB、p38 MAPK、ERK信號(hào)傳導(dǎo)通路對(duì)其的調(diào)控作用。以尋找一種藥物能夠抑

6、制鈣衛(wèi)蛋白的上調(diào)，進(jìn)而抑制炎性介質(zhì)的釋放，及是否需聯(lián)合應(yīng)用抗生素來(lái)治療妊娠期高血壓疾病開(kāi)辟一條新路。
　　 研究方法
　　 一、鈣衛(wèi)蛋白及其受體RAGE和TNF-α在妊娠期高血壓疾病中的表達(dá)
　　 采用免疫組化鏈霉菌抗生物素蛋白-過(guò)氧化物酶連接(SP)法檢測(cè)妊娠期高血壓疾病患者胎盤(pán)組織中鈣衛(wèi)蛋白、RAGE和TNF-α的表達(dá)，采用酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法，檢測(cè)妊娠期高血壓疾病患者血清中鈣衛(wèi)蛋白和TNF-α的表達(dá)

7、。
　　 二、鈣衛(wèi)蛋白對(duì)人滋養(yǎng)細(xì)胞表達(dá)TNF-α的誘導(dǎo)作用
　　 采用人鈣衛(wèi)蛋白作用于原代培養(yǎng)的早孕期細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞，以MTT法檢測(cè)鈣衛(wèi)蛋白對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞的增殖活性的影響，透射電鏡下觀(guān)察鈣衛(wèi)蛋白作用后滋養(yǎng)細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的改變，以ELISA法、Real Time PCR法檢測(cè)鈣衛(wèi)蛋白對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞釋放TNF-α在不同的時(shí)間效應(yīng)和劑量效應(yīng)下的影響。
　　 三、鈣衛(wèi)蛋白誘導(dǎo)人滋養(yǎng)細(xì)胞表達(dá)TNT-α的細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路探討
　　

8、 體外培養(yǎng)的人原代滋養(yǎng)細(xì)胞分別與ERK抑制劑PD98059、p38MAPK抑制劑SB203580和NF-κB抑制劑BAYl1-7082，以及PD98059聯(lián)合SB203580共孵育2h后，培養(yǎng)基中分別加入重組人鈣衛(wèi)蛋白作用6h。采用ELISA法測(cè)定培養(yǎng)上清中TNF-α的含量，用Real Time PCR法檢測(cè)培養(yǎng)細(xì)胞中TNF-αmRNA表達(dá)。
　　 結(jié)果
　　 一、鈣衛(wèi)蛋白及其受體RAGE和TNF-α在妊娠期高血壓疾病

9、中的表達(dá)
　　 妊娠期高血壓疾病組血清鈣衛(wèi)蛋白和TNF-α水平明顯高于對(duì)照組，兩組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)；重度子癇前期患者較輕度子癇前期患者明顯升高(P＜0.01)，而輕度子癇前期患者明顯高于妊娠期高血壓患者(P＜0.05)，妊娠期高血壓患者高于對(duì)照組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　 兩組孕婦絨毛間質(zhì)巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞中均有鈣衛(wèi)蛋白陽(yáng)性表達(dá)，主要位于細(xì)胞膜及細(xì)胞質(zhì)中。妊娠期高血壓疾病組胎盤(pán)組

10、織中鈣衛(wèi)蛋白陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于對(duì)照組，兩組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)；輕、重度子癇前期患者明顯高于對(duì)照組(P＜0.05，P＜0.01)，且輕、重度子癇前期患者間相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；妊娠期高血壓患者與對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。兩組孕婦胎盤(pán)絨毛合體滋養(yǎng)細(xì)胞及部分蛻膜細(xì)胞中均有RAGE、TNF-α陽(yáng)性表達(dá)，位于主要在細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)。妊娠期高血壓疾病組胎盤(pán)組織中RAGE、TNF-α陽(yáng)性表達(dá)率明

11、顯高于對(duì)照組，兩組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)；妊娠期高血壓和輕、重度子癇前期患者呈逐漸升高趨勢(shì)，輕、重度間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 妊娠期高血壓疾病組血清鈣衛(wèi)蛋白水平與TNF-α水平呈正相關(guān)(r=0.359，P＜0.05)；對(duì)照組血清鈣衛(wèi)蛋白水平與TNF-α水平無(wú)相關(guān)性(r=0.184，P＞0.05)。妊娠期高血壓疾病組胎盤(pán)組織鈣衛(wèi)蛋白水平與TNF-α水平呈正相關(guān)(r=0.383，P＜0.01)

12、；對(duì)照組胎盤(pán)組織鈣衛(wèi)蛋白水平與TNF-α水平無(wú)相關(guān)性(r=0.130，P＞0.05)。妊娠期高血壓疾病組及對(duì)照組血清鈣衛(wèi)蛋白表達(dá)與胎盤(pán)組織中鈣衛(wèi)蛋白的陽(yáng)性表達(dá)均呈正相關(guān)性(r=0.365，P＜0.0l；r=0.675，P＜0.01)。
　　 二、鈣衛(wèi)蛋白對(duì)人滋養(yǎng)細(xì)胞表達(dá)TNF-α的誘導(dǎo)作用
　　 鈣衛(wèi)蛋白作用24小時(shí)后藥物濃度與細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞增殖活性呈負(fù)相關(guān)(r=-0.735，P＜0.01)，即隨著鈣衛(wèi)蛋白藥物濃度的增加，

13、細(xì)胞生長(zhǎng)受到抑制。在800 ng/ml及其以上組表現(xiàn)更為明顯(P＜0.01)。但是，在小劑量藥物濃度(＜0.39ng/ml)刺激時(shí)，鈣衛(wèi)蛋白可刺激細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞的增殖，特別是在濃度0.20 ng/ml處更為明顯(P＜0.01)。作用時(shí)間為48小時(shí)，鈣衛(wèi)蛋白與細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞增殖活性的上述關(guān)系更為明顯。
　　 透射電鏡下可見(jiàn)，經(jīng)鈣衛(wèi)蛋白處理過(guò)的細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞核小，核膜模糊，核內(nèi)異染色質(zhì)邊集，呈半月?tīng)?，呈凋亡改變，胞質(zhì)內(nèi)線(xiàn)粒體多有嵴減

14、少，個(gè)別呈空泡樣變，胞膜多溶解。
　　 將人鈣衛(wèi)蛋白加入到原代培養(yǎng)的早孕期細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)液中能明顯刺激其TNF-α的分泌。在0～500ng/ml范圍內(nèi)，ELISA、Real Time PCR法檢測(cè)鈣衛(wèi)蛋白誘導(dǎo)滋養(yǎng)細(xì)胞的TNF-α分泌均增加，均呈明顯的劑量依賴(lài)性關(guān)系，在1000ng/ml鈣衛(wèi)蛋白對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞分泌TNF-α的誘導(dǎo)作用減弱。鈣衛(wèi)蛋白誘導(dǎo)滋養(yǎng)細(xì)胞的TNF-α分泌在3～48 h間均呈雙峰形，在6h和24h分泌TNF-α增強(qiáng)

15、。
　　 三、鈣衛(wèi)蛋白誘導(dǎo)人滋養(yǎng)細(xì)胞表達(dá)TNF-α的細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路探討
　　 ELISA法檢測(cè)鈣衛(wèi)蛋白誘導(dǎo)人滋養(yǎng)細(xì)胞表達(dá)TNF-α增加，PD98059、SB203580及BAYll-7082均可顯著下調(diào)鈣衛(wèi)蛋白誘導(dǎo)人滋養(yǎng)細(xì)胞產(chǎn)生TNF-α(P＜0.05)，同時(shí)使用PD98059和SB203580可增強(qiáng)抑制TNF-α的分泌水平(P＜0.05)。
　　 Real Time PCR法檢測(cè)鈣衛(wèi)蛋白誘導(dǎo)人滋養(yǎng)細(xì)胞表達(dá)TN

16、F-α mRNA增加，PD98059、SB203580或BAYll-7082均可顯著下調(diào)鈣衛(wèi)蛋白誘導(dǎo)人滋養(yǎng)細(xì)胞表達(dá)TNF-αmRNA(P＜0.05)，PD98059和SB203580具有協(xié)同抑制作用(P＜0.05)。
　　 結(jié)論:
　　 1、鈣衛(wèi)蛋白、RAGE、TNF-α蛋白在妊娠期高血壓疾病病情加重進(jìn)展中表達(dá)逐漸上調(diào)，有望成為子癇前期嚴(yán)重程度評(píng)估、疾病預(yù)測(cè)和判斷預(yù)后的有效指標(biāo)。
　　 2、高濃度的鈣衛(wèi)蛋白對(duì)體外