1、大連理工大學(xué)博士學(xué)位論文兩種蝮蛇毒類凝血酶基因的克隆表達(dá)與分離純化姓名：楊青申請學(xué)位級別：博士專業(yè)：生物化工指導(dǎo)教師：安利佳20020101摘要物主要以可溶性的蛋白質(zhì)形式存在于細(xì)胞質(zhì)中。首次將大連蛇島蝮蛇毒類凝血酶成熟基因克隆到表達(dá)載體pPIC9K中，經(jīng)電激轉(zhuǎn)化至畢氏酵母菌株GSll5中，再經(jīng)甲醇誘導(dǎo)，在150ml搖瓶中獲得細(xì)胞外分泌表達(dá)產(chǎn)物。對菌體培養(yǎng)條件進(jìn)行的探索表明：蛋白表達(dá)的最佳pH值應(yīng)為60，最佳誘導(dǎo)時間為36小時，培養(yǎng)基為營

2、養(yǎng)豐富的復(fù)合培養(yǎng)基。表達(dá)產(chǎn)物的活性通過檢測其精氨酸酯酶活性和纖維蛋白原的凝結(jié)活性確定，表達(dá)量通過精氨酸酯酶活性估算約為4mg／l(培養(yǎng)液)。為研究重組類凝血酶的純化方法，選取含大連蛇島蝮蛇類凝血酶基因的畢氏酵母，其表現(xiàn)型為甲醇快速生長型HisMut的表達(dá)菌株，在500ml搖瓶中培養(yǎng)，甲醇誘導(dǎo)分泌表達(dá)。上清液中重組蝮蛇毒類凝血酶的純化是通過設(shè)計的不同分離純化方法組合進(jìn)行的，并對每一種組合進(jìn)行了活力與純度及回收率的評價，結(jié)果表明兩種組合方式

3、都具有一定的實用性和可操作性。通過對類凝血酶與胰蛋白酶的同源性分析比較，發(fā)現(xiàn)二者的催化部位結(jié)構(gòu)非常相似，并且被相同的小分子化合物benzamidine競爭性抑制，首次設(shè)計將用于親和分離胰蛋白酶的benzamidine用到純化類凝血酶上來，實驗結(jié)果表明分離達(dá)到了較好的效果。與天然蛇毒類凝血酶一致，當(dāng)用三肽Pnitroanillde衍生物作為底物時，分泌表達(dá)的重組大連蛇島蝮蛇毒類凝血酶具有較強的生色底物活性，但用精氨酸甲酯如TAME(N口p