1、遺傳性非息肉病性結(jié)直腸癌(hereditarynonpolyposiscolorectalcancer，HNPCC)是一種常染色體顯性遺傳性惡性腫瘤綜合征，外顯率高達(dá)80％～90％，占所有結(jié)直腸癌的2％～15％。HNPCC與散發(fā)性結(jié)直腸癌相比，在發(fā)病機制上、臨床表現(xiàn)上以及治療方案的選擇和隨訪方案的制定上均不盡相同，將兩者區(qū)分開來不僅具有實際的臨床意義，而且有利于遺傳學(xué)咨詢，其已被許多國家重視，歐美發(fā)達(dá)國家、韓國、日本等成立了完善的登記和

2、分析機構(gòu)，并進(jìn)行了深入的分子遺傳學(xué)研究。為了在國際間更好地研究HNPCC，1989年成立了HNPCC國際合作小組(InternationalCollaborativeGrouponHereditaryNonpolyposisColorectalCancer，ICG—HNPCC)。自1990年以來，Amsterdam標(biāo)準(zhǔn)(工、II)、日本標(biāo)準(zhǔn)、Bethesda指導(dǎo)綱要等篩選HNPCC家系的臨床標(biāo)準(zhǔn)相繼被提出。然而，HNPCC的確診有賴于錯

3、配修復(fù)(mismatchrepair，MMR)基因的胚系病理性突變的檢出。大量的研究資料表明，在世界范圍內(nèi)與HNPCC相關(guān)的MMR基因突變位點分布廣泛，缺少突變熱點。我國人群MMR基因的突變譜系如何?有相關(guān)突變熱點嗎?相關(guān)的報道甚少。結(jié)直腸癌已是我國最常見的惡性腫瘤之一，并有逐年上升的趨勢，目前已成為女性第二位、男性第三位高發(fā)惡性腫瘤，再之，我國是一個實行計劃生育的國家，家系的正變得越來越小，HNPCC的家族傾向變得也越來越不明顯，所以

4、在我國進(jìn)行該領(lǐng)域的系統(tǒng)研究必要而緊迫。本研究共分以下三部分，分別報告如下： 第一部分基于外周血mRNA的MLH1和MSH2基因胚系突變檢測 目的：1．在國內(nèi)建立一種利用耐熱性逆轉(zhuǎn)錄酶和特異引物、基于外周血mRNA異常診斷HNPCC家系方法；2．探討中國人群HNPCC家系的MLHl和MS＃2基因胚系突變類型和譜系。 方法：收集符合Amsterdam標(biāo)準(zhǔn)(包括I、II)家系19個、日本標(biāo)準(zhǔn)¨個、Bethesda指導(dǎo)綱

5、要29個共1.00個家系成員外周血標(biāo)本，提取mRNA和DNA；利用耐熱性逆轉(zhuǎn)錄酶和MLHl、MSH2特異引物，特異地逆轉(zhuǎn)錄該兩基因的mRNA；PCR擴增逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(cDNA)；測序分析PCR產(chǎn)物；利用基于基因組DNA的擴增測序，驗證基于mRNA擴增測序檢出的部分新突變。 結(jié)果：在59個HNPCC的臨床家系中，17個家系被檢出MLHl和MSH2胚系突變，家系的總突變率為28．8％，分布于15個位點上，其中9個MLHJ突變(60％，

6、9／15)，6個MSH2突變(40％，6／15)。6個是已報道的病理性突變，9個是尚未報道的新突變。突變的類型包括錯義突變(10個)、終止密碼子突變(1個)、移碼突變(1個)、同義突變(2個)和非編碼區(qū)突變(1個)。MLHl的突變分別分布于外顯子2(2個)、8(1個)、12(2個)、16(2個)、4(1個)和外顯子19(1個)，其中兩家系的突變位于12外顯子的同一位點上。MSH2的突變分別分布于外顯子1(1個)、2(1個)、3(1個)、

7、7(1個)、12(1個)和外顯子13(1個)，其中兩家系的突變位于3外顯子的同一位點上。 結(jié)論：1．基于外周血mRNA的基因測序方法能檢測出MMR基因的胚系突變，與基于基因組DNA測序方法相比，成本較低。2．ML＃I基因的胚系突變率略高于MSH2者。3．在中國人群中，與HNPCC相關(guān)的MMR基因胚系突變類型可能以錯義突變?yōu)橹鳌?．Amsterdam標(biāo)準(zhǔn)對HNPCC預(yù)示的陽性率高于日本標(biāo)準(zhǔn)；日本標(biāo)準(zhǔn)對HNPCC預(yù)示的陽性率高于Be

8、thesda指導(dǎo)綱要。5．ML＃I基因的第2、12、16外顯子和MSH2基因的第3外顯子可能是中國人群的高突變外顯子。 第二部分JtLHl和MSH2胚系新錯義突變功能性的初步評價 目的：1．評價2個MLHl新錯義突變和3個MSH2新錯義突變的功能性。2．判斷有新錯義突變的家系是否是HNPCC家系。 方法：整理新突變家系的患病譜系，收集新突變患者腫瘤組織，使用一組國際HNPCC合作小組推薦的5個微衛(wèi)星位點，包括單核

9、苷重復(fù)序列BAT25、BAT26和雙核苷重復(fù)序列D2S123、D5S346和D17S250，PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)ABI3lODNA自動分析儀檢測，以各患者外周血標(biāo)本作為內(nèi)對照，利用Genescan軟件分析判斷微衛(wèi)星不穩(wěn)定(microsatel¨teinstability，MSI)狀態(tài)。利用Envision免疫組化(immunohistiochemistry，IHC)法檢測MLHl和MSH2蛋白的表達(dá)情況；以腫瘤組織間質(zhì)細(xì)胞和浸潤的淋巴細(xì)胞為

10、對照。將MSI、IHC結(jié)果和各患者家系的臨床資料相結(jié)合，綜合評價各突變的功能性。 結(jié)果：1．家系資料：本研究6家系共有患者20人，平均初發(fā)最年輕年齡為36．7歲，有多原發(fā)癌者3人，右半結(jié)腸癌8個(44．4％，8／18)，左半結(jié)腸癌lO個(63．6％，10／18)。2．MSI檢測結(jié)果：在檢測的6個家系患者中，1個患者的腫瘤組織在全部5個微衛(wèi)星點上出現(xiàn)新生峰，3個患者的腫瘤組織分別有4個微衛(wèi)星點出現(xiàn)新生峰，2個患者的腫瘤組織分別在3

11、個微衛(wèi)星點上出現(xiàn)新生峰；在5個微衛(wèi)星點上，6個患者的外周血對照DNA均未出現(xiàn)新生峰。根據(jù)微衛(wèi)星不穩(wěn)定性的判斷標(biāo)準(zhǔn)，該6個患者的腫瘤組織均呈高度微衛(wèi)星不穩(wěn)定性。3．IHC檢測結(jié)果：在檢測的6患者腫瘤組織中，癌旁的腺體、間質(zhì)纖維細(xì)胞、浸潤的淋巴細(xì)胞等非腫瘤成分均呈MLHl和MSH2蛋白染色陽性。兩蛋白在癌旁腺體的表達(dá)主要定位于腺窩以下的腺上皮的細(xì)胞核上。問質(zhì)的纖維細(xì)胞和浸潤的淋巴細(xì)胞較彌漫的核陽性。有MLHl突變的2患者M(jìn)LHl蛋白1個患者

12、失表達(dá)，另1患者弱表達(dá)，而MSH2蛋白表達(dá)正常。有MSH2突變的4患者M(jìn)SH2蛋白均失表達(dá)，而MLHl蛋白表達(dá)正常。MLttl、MSH2基因突變與其蛋白異常表達(dá)符合率均為100％(6／6)。 結(jié)論：6家系的5個突變均有功能改變，為病理性，即：MLttl第12外顯子、412密碼子纈氨酸→甘氨酸突變、第16外顯子、581密碼子的脯氨酸→亮氨酸突變以及MSH2第3外顯子、127密碼子的天冬酰氨→組氨酸突變、第7外顯子、367密碼子的纈

13、氨酸→甘氨酸突變和第13外顯子、646密碼子的蘇氨酸→精氨酸突變均為病理性。該6家系均為HNPCC家系。 第三部分HNPCC臨床家系外周血ML肌基因mRNA的定量分析 目的：1．探討符合不同標(biāo)準(zhǔn)的HNPCC臨床家系外周血MLHl基因mRNA量的表達(dá)情況。2．建立一種基于外周血新的分子篩選HNPCC家系的方法。 方法：1．標(biāo)本準(zhǔn)備：收集與本研究第一部分相同家系成員的外周血標(biāo)本，提取各成員的總RNA。2．逆轉(zhuǎn)錄：利用

14、耐熱性逆轉(zhuǎn)錄酶和隨機引物，逆轉(zhuǎn)錄各成員的RNA。3．利用MLHlTaqMan熒光探針和特異引物進(jìn)行實時熒光定量PCR擴增逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(cDNA)；以保守基因TAMRA作為對照；熒光定量檢測結(jié)果采用opticonmonitor1．07軟件進(jìn)行分析。4．將每一標(biāo)本所得MLH1基因拷貝數(shù)與其相對應(yīng)的HBA2基因拷貝數(shù)相除來校正不同標(biāo)本之間RNA的質(zhì)量和逆轉(zhuǎn)錄效率的差異，得出MLHl基因相對表達(dá)量；比較符合不同HNPCC臨床家系MLHl基因mRN

15、A的表達(dá)差異；在符合Amsterdam標(biāo)準(zhǔn)家系間，比較有突變和無突變家系MLHl基因mRNA的表達(dá)差異。 結(jié)果：1．各成員MLH!基因的mRNA的相對表達(dá)量用MLHl／YB,42~105表示。在符合Amsterdam標(biāo)準(zhǔn)的家系中ML＃i基因的mRNA相對表達(dá)量為2．98×10-6～64．32，平均值為10．91；在符合日本標(biāo)準(zhǔn)的家系中相對表達(dá)量為7．14×10～13．56，平均值為1．74；在符合Bethesda指導(dǎo)綱要的家系中

16、相對表達(dá)量為6．25×10～44．14，平均值為4．17。2．在符合Amsterdam標(biāo)準(zhǔn)的臨床家系，有突變和無突變成員的MLHl基因mRNA相對表達(dá)量有顯著性差異(P0．05)。 結(jié)論：1．TaqMan實時熒光定量PCR技術(shù)能用于ML＃i基因的mRNA定量分