1、治療終末期肝病最有效的方法之一就是原位肝移植(orthotopiclivertransplantation，OLT)，然而，由于供體的缺乏、免疫排斥和高額費用等問題，OLT的廣泛應(yīng)用受到了限制。肝細胞移植(hepatocytestransplantationHCT)經(jīng)過近30年的發(fā)展，正由動物實驗向臨床過渡，初步結(jié)果顯示，肝細胞移植在急慢性肝衰竭和遺傳代謝性肝病方面具有很好的應(yīng)用前景，但同樣面臨肝細胞來源有限，排斥反應(yīng)等問題的困擾。雜交

2、型生物人工肝(Hybridbioartificialliver,HBAL)治療可以使終末期肝病病人橋接(bridge)肝移植，而且由于肝細胞具有強大的再生能力，臨時應(yīng)用生物人工肝也可以暫時代償肝功能，促進肝細胞再生，部分患者肝功能完全恢復(fù)正常。但作為HBAL核心生物材料的肝細胞來源問題未得到根本解決，使HBAL的臨床應(yīng)用遠未達到理論上的預(yù)期效果。研究證明人骨髓來源的多能成體祖細胞(Multipotentadultprogenitorce

3、llsfrombonemarrow，MAPCs)具有向肝樣細胞分化的潛能，由于其具有易于增殖、調(diào)控、供源豐富、容易獲取、有自體供源避免免疫排斥等優(yōu)點，有望成為理想的組織工程細胞來源。本課題組前期實驗通過密度梯度離心—貼壁培養(yǎng)篩選—免疫磁性雙陰性分選(magneticactivatedcellsorting，MACS)三個步驟高效率地純化分選出骨髓間充質(zhì)干細胞(mesenchymalstemcells，MSCs)亞群MAPCs(CD45-

4、，GlyA-)，并將之命名為ZHJ-MAPCs(Zhujiang-MAPCs)。通過改良細胞培養(yǎng)基等方法，我們建立了ZHJ-MAPCs的傳代培養(yǎng)技術(shù)(結(jié)果尚未發(fā)表)。 第一部分：ZHJ-MAPCs特征表型及細胞遺傳學(xué)初步分析鑒定目的對經(jīng)過CD45、GlyA免疫微磁珠體外負分選純化并傳代培養(yǎng)的ZHJ-MAPCs進行體外部分細胞學(xué)鑒定，了解其特異性標志物表達及增殖、傳代過程中的遺傳學(xué)穩(wěn)定性。 方法(1)取原代凍存的經(jīng)過CD4

5、5、GlyA免疫微磁珠體外負分選純化的人ZHJ-MAPCs復(fù)蘇培養(yǎng)，傳代后進行CD29、CD44、CD34和HLA-DR流式細胞分析，初步了解ZHJ-MAPCs特異性表型的表達情況。(2)分別在傳至第6代和第13代時進行細胞核型分析了解細胞核型變化。 結(jié)果(1)流式細胞儀檢測ZHJ-MAPCs中CD29陽性表達細胞比率為99.2％，CD44陽性細胞比率為98.3％，CD34陽性細胞比率為1.2％，HLA-DR陽性細胞比率為5.3

6、％。(2)ZHJ-MAPCs在增殖傳代過程中表現(xiàn)出非正常二倍體特征，染色體干系數(shù)目在第6、13代均為55～58條，占80％，染色體數(shù)介于超二倍體和亞三倍體之間，鏡下見細胞均發(fā)生染色體變異，且變異形態(tài)多樣。 結(jié)論(1)ZHJ-MAPCs具有骨髓間充質(zhì)干細胞的特征及較高的純度。(2)ZHJ-MAPCs在增殖傳代過程中表現(xiàn)出非正常二倍體特征，染色體數(shù)介于超二倍體和亞三倍體之間，染色體變異形態(tài)多樣。 第二部分：ZHJ-MAPCs

7、與人肝細胞系L02體外共培養(yǎng)向肝樣細胞分化的實驗研究目的探索人骨髓來源ZHJ-MAPCs在與人肝細胞系L02在體外共培養(yǎng)條件下誘導(dǎo)分化為肝細胞的可行性，為其在組織工程學(xué)研究和臨床醫(yī)學(xué)中的廣泛應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。 方法(1)間接共培養(yǎng)：將分別接種于蓋玻片上的第4代ZHJ-MAPCs和人肝細胞系L02(密度均為1×105/ml)按照各50％比例共置于直徑10cm培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)液共通，實現(xiàn)間接共培養(yǎng)。分別于間接共培養(yǎng)第1、3、5、7天免疫細

8、胞化學(xué)鑒定ZHJ-MAPCs的ALB、AFP、CK-18、CK-19等肝細胞特征性表型表達變化情況，并設(shè)陽性對照(單獨培養(yǎng)的L02細胞)和陰性對照(單獨培養(yǎng)未經(jīng)誘導(dǎo)的ZHJ-MAPCs)，計數(shù)陽性細胞比率；(2)直接共培養(yǎng)：將CFSE熒光(綠色)標記的第4代ZHJ-MAPCs與L02(密度均為1×104/ml)按照各50％比例混合后接種于激光共聚焦顯微鏡檢查專用培養(yǎng)皿內(nèi)，實現(xiàn)直接共培養(yǎng)。5天后用SABC-Cy3免疫熒光(紅色)雙標后在激

9、光共聚焦顯微鏡下分別觀察ZHJ-MAPCs表達ALB、AFP、CK-18的情況。同樣設(shè)陽性對照(單獨培養(yǎng)的CFSE標記L02細胞)和陰性對照(單獨培養(yǎng)的CFSE標記ZHJ-MAPCs)。 結(jié)果(1)間接共培養(yǎng)結(jié)果：AFP作為不成熟肝細胞的表型標志，間接共培養(yǎng)誘導(dǎo)的ZHJ-MAPCs在間接共培養(yǎng)第1天表現(xiàn)為強陽性表達，隨后表達逐漸減弱，至第7天，AFP的陽性表達已經(jīng)很少。而ALB在第1天有可疑陽性表達，間接共培養(yǎng)第3天，ALB即出

10、現(xiàn)較強的陽性表達，第5天，ALB的陽性表達既達到高峰，第7天，密集生長的細胞仍廣泛的陽性表達ALB。間接共培養(yǎng)第1、3天檢測CK-18均為陰性，至第5天CK-18開始出現(xiàn)陽性表達，第7天CK-18陽性表達較前增強。CK-19在各時間點均為陰性著色。陽性對照細胞ALB及CK18有較強的陽性表達，AFP弱陽性表達，CK19陰性表達。陰性對照細胞均為陰性表達。(2)直接共培養(yǎng)結(jié)果：CFSE熒光標記的ZHJ-MAPCs和L02直接共培養(yǎng)，在第5

11、天行SABC-Cy3免疫熒光染色后行激光共聚焦顯微鏡掃描，結(jié)果鏡下表達黃色熒光的細胞即是向肝細胞分化的ZHJ-MAPCs，為陽性細胞；單純表達綠色熒光的細胞為未分化的ZHJ-MAPCs；單純表達紅色熒光的細胞為L02細胞。結(jié)果ALB和CK18檢測時，較多細胞胞漿內(nèi)出現(xiàn)黃色熒光表達，而AFP陽性熒光表達則僅出現(xiàn)在極個別細胞漿內(nèi)，該結(jié)果與陽性對照細胞熒光表達類似，而陰性對照細胞未見有陽性熒光表達。 結(jié)論(1)與人肝細胞系L02間接共