1、目的：白細(xì)胞介素6(Interleukin-6,IL-6)由多種細(xì)胞如單核細(xì)胞,成纖維細(xì)胞,內(nèi)皮細(xì)胞,肝細(xì)胞,淋巴細(xì)胞,腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生的多功能細(xì)胞因子,可以參與機(jī)體多種反應(yīng),比如刺激多種細(xì)胞增殖分化,骨髓造血,自身免疫和機(jī)體防御等。IL-6在哮喘、多發(fā)性硬化、慢性類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎,炎癥性腸炎等多種免疫性疾病中水平異常增高,且阻斷IL-6后疾病嚴(yán)重程度減輕。本課題根據(jù)鼠IL-6受體結(jié)構(gòu)特點(diǎn)構(gòu)建表達(dá)出可以阻斷IL-6信號(hào)通路的鼠IL-6受體融合

2、蛋白(mouse IL-6 receptor fusion protein,mIL-6-RFP),為后期研究IL-6在炎癥性疾病模型中的作用奠定了基礎(chǔ)。
　　方法：首先設(shè)計(jì)引物,以 mIL-6-RFP-pcDNA3.1質(zhì)粒為模板擴(kuò)增出目的基因mIL-6-RFP。隨后將mIL-6-RFP與高效克隆PCR產(chǎn)物的專用載體pMD18-T連接后轉(zhuǎn)化 XL1-BLue。擴(kuò)大培養(yǎng)后提取質(zhì)粒為 mIL-6-RFP-pMD18-T,將mIL-6-R

3、FP-pMD18-T與桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)轉(zhuǎn)移載體pFastBacHTA酶切后連接,而后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α。擴(kuò)大培養(yǎng)后提取質(zhì)粒為mIL-6-RFP-pFastBacHTA,經(jīng)測(cè)序鑒定正確后轉(zhuǎn)化含有Bacmid載體的大腸桿菌 DH10Bac,在DH10Bac菌體內(nèi),mIL-6-RFP-pFastBacHTA上的mIL-6-RFP轉(zhuǎn)座到Bacmid的乳糖操縱子盒式結(jié)構(gòu)中得到重組 Bacmid。重組 Bacmid通過(guò)連續(xù)兩次抗生素加藍(lán)白斑篩選

4、獲得陽(yáng)性單克隆,擴(kuò)大培養(yǎng)后用大型質(zhì)粒提取試劑盒提取重組Bacmid。采用PCR方法鑒定重組Bacmid,引物為pUC/M13。鑒定結(jié)果正確后,利用脂質(zhì)體Cellfectin介導(dǎo)重組Bacmid轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞,并通過(guò)觀察細(xì)胞病變確定轉(zhuǎn)染是否成功。當(dāng)轉(zhuǎn)染成功后收集細(xì)胞上清為具有感染性的第一代重組病毒粒子。隨后用第一代重組病毒粒子感染Sf9收集上清為第二代病毒,同時(shí)收集細(xì)胞提取細(xì)胞內(nèi)總蛋白經(jīng)Western Blot鑒定目的蛋白是否表達(dá)。而后用

5、第二代病毒感染Sf9獲得第三代病毒。采用空斑試驗(yàn)檢測(cè)第三代病毒的滴度。蛋白表達(dá)前,在24孔板上摸索蛋白表達(dá)的優(yōu)化條件,同時(shí)將單層培養(yǎng)的細(xì)胞馴化為懸浮旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)。當(dāng)懸浮培養(yǎng)達(dá)到600ml后用第三代病毒感染Sf9。收集細(xì)胞及培養(yǎng)基進(jìn)行蛋白純化獲得大量目的蛋白mIL-6-RFP。
　　結(jié)果：經(jīng)過(guò)基因重組技術(shù)成功將目的基因插入轉(zhuǎn)移載體 pFastBacHTA得到重組pFastBacHTA,命名為mIL-6RFP-pFastBacHTA,重組

6、質(zhì)粒經(jīng)測(cè)序鑒定正確后成功轉(zhuǎn)化DH10Bac細(xì)菌,挑選經(jīng)抗生素及藍(lán)白斑兩次篩選成功獲得出的白色陽(yáng)性單克隆,擴(kuò)大培養(yǎng)后用大型質(zhì)粒提取試劑盒成功提取出重組Bacmid,經(jīng)PCR鑒定后約在4500bp處左右出現(xiàn)目的條帶。重組Bacmid轉(zhuǎn)染昆蟲細(xì)胞Sf9,轉(zhuǎn)染后第五天出現(xiàn)細(xì)胞病變說(shuō)明轉(zhuǎn)染成功,Western Blot鑒定顯示感染組細(xì)胞在94kd處有特異蛋白的表達(dá),而正常組則沒有,與預(yù)期結(jié)果一致,進(jìn)一步證明轉(zhuǎn)染成功。收集轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞上清獲得第一代

7、重組病毒粒子,并成功擴(kuò)增病毒至第三代重組病毒粒子,通過(guò)空斑實(shí)驗(yàn)計(jì)算出第三代病毒滴度為4×107 PFU/ml。蛋白表達(dá)條件優(yōu)化在24孔板上進(jìn)行,得到優(yōu)化條件為感染復(fù)數(shù)MOI=8,接種72h后收集蛋白。單層靜止培養(yǎng)的Sf9細(xì)胞成功馴化為懸浮旋轉(zhuǎn)培養(yǎng),適用于后期蛋白表達(dá)。第三代重組病毒粒子感染復(fù)數(shù)MOI=8感染600ml懸浮旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)昆蟲細(xì)胞Sf9,病毒接種后72h收集蛋白,成功收獲全部培養(yǎng)上清及細(xì)胞。采用蛋白純化儀器AKTApurifier