1、目的：通過酵母雙雜合體系研究乙型肝炎病毒X蛋白(HBx)與細(xì)胞色素C氧化酶3(COXIII)相互作用的位點(diǎn)。 方法：用常規(guī)PCR和分子克隆技術(shù)構(gòu)建HBV X變異體2種(X1編碼HBV X蛋白1-72氨基酸，X2編碼HBV X蛋白1-117氨基酸)到穿梭質(zhì)粒pAS2-1(含GAL4-BD)上，通過醋酸鋰方法轉(zhuǎn)化入酵母AH109，以pAS2-1/X全長(zhǎng)為對(duì)照；通過Western Blot的方法驗(yàn)證HBV X全長(zhǎng)及變異體-BD融合蛋白

2、在酵母細(xì)胞中的表達(dá)；經(jīng)過濾膜轉(zhuǎn)印法檢測(cè)它們的自激活作用，將pAS2-1/X全長(zhǎng)及變異體與pACT2/COXIII(pACT2含GAL4-AD)分別轉(zhuǎn)化入酵母AH109及Y187中，進(jìn)行酵母雙雜交，在SC/-trp-leu檢測(cè)轉(zhuǎn)化效率，通過藍(lán)白斑篩選檢測(cè)β-半乳糖苷酶的活性從而得出HBx與COXIII的大致作用位點(diǎn)。 結(jié)果：pAS2-1/X變異體通過雙酶切，PCR均檢測(cè)出相應(yīng)的片段，測(cè)序結(jié)果也符合預(yù)期。提取已轉(zhuǎn)化入變異體的酵母AH

3、109的DNA及蛋白，PCR和Western Blot驗(yàn)證pAS2-1/X全長(zhǎng)及變異體-BD融合蛋白在酵母AH109中的成功表達(dá)。濾膜轉(zhuǎn)印法排除了它們的自激活作用。經(jīng)過與已轉(zhuǎn)化有pACT2/COXIII的酵母Y187雙雜交后，在SC/-trp-leu平板上有菌落生成，通過藍(lán)白斑篩選，pAS2-1/X1及pAS2-1/X2均未使菌落變藍(lán)。 結(jié)論：成功構(gòu)建pAS2-1/X變異體，并在酵母中成功表達(dá)。pAS2-1/X變異體1和2均無自