1、結直腸癌（colorectal cancer，CRC）是常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，其發(fā)病率位居男性惡性腫瘤的第三位及女性惡性腫瘤的第二位。全球男性CRC每年新發(fā)病例高達近75萬，每年約37萬男性死于CRC，CRC死亡率居男性癌癥死亡率第四位。全球女性CRC每年新發(fā)病例高達61萬，每年32萬女性死于CRC，CRC死亡率居女性癌癥死亡率第三位。CRC已成為嚴重危害人類健康的疾病，受到各國衛(wèi)生機構的重視。目前只有早期發(fā)現(xiàn)及根治性結直腸癌手術可以

2、治愈該病。然而，一部分CRC患者在首次就診時已伴有遠處轉移，處于結直腸癌晚期，無法手術根治。晚期CRC的治療方法包括局部放療、全身化療、中醫(yī)藥治療及靶向藥物治療。局部放療及全身化療副作用大，而且療效有限。目前常用的CRC化療方案為5-氟尿嘧啶、依立替康、甲酰四氫葉酸、奧沙利鉑、卡培他濱組成的聯(lián)合化療方案。在全身化療治療過程中CRC常出現(xiàn)耐藥，并導致治療失敗。隨著對CRC發(fā)病機制研究的深入，多種CRC治療靶點被發(fā)現(xiàn)。靶向藥物治療已成為新的

3、有前途的腫瘤治療方法，具有精準、安全及損傷小等特點，逐步成為晚期CRC治療的理想選擇方案，并可以作為化療的聯(lián)合方案。血管內皮生長因子-A（vascular endothelial growth factor A，VEGF-A）抑制劑貝伐珠單抗及表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）抑制劑西妥昔單抗已被成功用于晚期CRC的治療。然而，CRC的發(fā)生及發(fā)展是多信號通路的，阻斷單一信號通路

4、后腫瘤其他信號通路常發(fā)生代償，貝伐珠單抗及西妥昔單抗治療的CRC患者中仍然存在腫瘤耐藥發(fā)生。研究CRC其他的信號通路不僅有利于進一步明確CRC發(fā)病機制，而且有助于發(fā)現(xiàn)新的晚期CRC治療靶點。如果能將新的靶向藥物應用于臨床將有助于進一步改善CRC患者的預后。
　　環(huán)氧化酶（cyclooxygenase，COX）是前列腺素(prostaglandins，PG)合成的限速酶，COX將花生四烯酸轉化為PGG2，PGG2進一步被轉化為PGH

5、2，PGH2進而生成具有生物活性的PG（PGE2、PGD2和血栓素A2等），在炎癥、應激及消化道黏膜保護等生理過程中發(fā)揮重要作用。在生物體內，COX存在COX-1、COX-2、及COX3三種同工酶。COX-1為結構性酶，主要存在于血管、胃和腎等組織中，參與胃黏膜保護、血流調節(jié)及血小板聚集調節(jié)等生理功能。COX-3為COX-1的剪接變異體，目前其功能尚不清楚。與COX-1結構性表達不同，COX-2在組織損傷及炎癥時表達增加，COX-2是典

6、型的誘導型COX。研究發(fā)現(xiàn)超過50%的腫瘤組織COX-2高表達，這表明COX-2在腫瘤發(fā)生過程中具有重要作用，是重要的促腫瘤因子。
　　COX-2的產物PGE2通過G蛋白偶聯(lián)受體（G protein coupled receptor，GPCR）家族的EP1、EP2、EP3、 EP4及過氧化物酶體增殖物激活受體（peroxisome proliferator-activated receptors，PPAR）作用于細胞膜，進而將信號

7、傳導入細胞內。研究表明，PGE2通過EP4激活磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol3-kinase，PI3K）和蛋白激酶B（protein kinase B，PKB）抑制細胞凋亡，進而促進細胞增殖。PGE2還可以激活絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信號通路，進而促進腫瘤生長。PGE2也可以誘導抗凋亡蛋白Bcl-2表達，并增加核轉錄因子kappa B（

8、nuclear factor kappa B，NF-ΚB）活性，進而抑制凋亡，促進腫瘤發(fā)生。同時，COX-2還具有促進血管生成的作用。COX-2誘導細胞產生血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF），VEGF能夠促進血管內皮細胞遷移，進而促進血管生成。還有研究表明，COX-2通過調控EP4介導的NOTCH/WNT通路誘導腫瘤干細胞發(fā)生。腫瘤微環(huán)境的免疫功能常常發(fā)生由Th1主導的免疫

9、反應向由Th2主導的免疫反應轉換。腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、干擾素-γ（interferon-γ，IFN-γ）和白介素-2（interleukin-2，IL-2）可以促進Th1細胞增殖，而白介素-4（interleukin-4，IL-4）、白介素-6（interleukin-6，IL-6）和白介素-10（interleukin-10，IL-10）促進Th2細胞增殖。COX-2通過PG

10、E2下調腫瘤細胞TNF-α、IFN-γ和IL-2表達，并上調腫瘤細胞IL-4、IL-6和IL-10表達，進而促進腫瘤微環(huán)境免疫反應轉換，使腫瘤逃避機體免疫監(jiān)控?？梢?，COX-2可以通過促進細胞生長、抑制凋亡、促進腫瘤干細胞形成及促進腫瘤免疫逃避促進腫瘤發(fā)生，COX-2是重要的促腫瘤因子，可以作為腫瘤治療靶點。
　　X線修復交叉互補蛋白5（X-ray repair cross-complementing protein5，XRCC5

11、）亦稱為Ku80，由XRCC5基因編碼，與XRCC6共同構成XRCC5/XRCC6異源二聚體，是一種DNA依賴性蛋白激酶復合物（DNA-dependent protein kinase complex，DNA-PK）。XRCC5基因位于2q33-34，編碼732個氨基酸，XRCC5蛋白分子質量約為86kDa。研究證實，XRCC5蛋白參與DNA雙鏈斷裂修復和重組，維持染色體及基因組穩(wěn)定性。XRCC5/XRCC6二聚體可以結合DNA雙鏈斷裂

12、末端，是DNA非同源末端連接修復的必要組分。研究還表明，XRCC5的功能并不局限于DNA雙鏈斷裂修復，XRCC5還可以作為粘附因子，參與腫瘤細胞的粘附、遷移及侵襲。XRCC5在多種腫瘤組織中高表達（包括結直腸癌），這表明XRCC5也是一種促癌因子，參與腫瘤發(fā)生發(fā)展。既往研究表明，XRCC5可以通過與CBP協(xié)同作用增加COX-2表達促進肺癌細胞的增殖。然而，XRCC5與COX-2在結直腸癌發(fā)生發(fā)展中的相互作用及其機制尚不明確。
　　

13、本研究通過生物素-鏈霉親和素垂釣實驗尋找并鑒定結腸癌細胞中COX-2表達調控中未知的且必須的轉錄因子時，發(fā)現(xiàn)XRCC5能夠特異性地結合在COX-2啟動子上，進而激活COX-2轉錄，上調COX-2表達。通過調控XRCC5在結腸癌細胞中的表達，驗證XRCC5對COX-2的調控作用。通過細胞增殖實驗及動物成瘤實驗驗證XRCC5通過COX-2影響結腸癌生長。為進一步明確XRCC5調控COX-2的機制，我們通過進一步的免疫共沉淀實驗還發(fā)現(xiàn)轉錄共活

14、化子p300參與XRCC5調控COX-2的表達過程。而后，我們還驗證了p300通過調控XRCC5乙?；竭M而調控COX-2表達的機制。我們的研究闡明了XRCC5及p300協(xié)同調控COX-2促進CRC生長的機制，為XRCC5成為CRC治療靶點提供了理論及實驗依據(jù)。
　　第一部分 XRCC5作為COX-2啟動子區(qū)結合蛋白調控結腸癌細胞中COX-2表達
　　目的：
　　在結腸癌細胞中通過生物素-鏈霉親和素垂釣實驗尋找并鑒定

15、與COX-2啟動子區(qū)特異性結合的調節(jié)蛋白，并驗證該調節(jié)蛋白對結腸癌細胞COX-2表達的影響。
　　方法：
　　為了鑒定潛在的COX-2啟動子區(qū)特異性結合蛋白，我們設計了一段478bp（-30至-508）生物素標記的雙鏈DNA探針。應用生物素-鏈霉親和素垂釣實驗在四種結腸癌細胞系（RKO、LoVo、DLD-1和SW480）中分離出COX-2啟動子區(qū)特異性結合蛋白復合物。對該蛋白復合物進行洗脫沉淀，采用SDS-PAGE及銀染顯色

16、顯示可能的COX-2啟動子區(qū)特異性結合蛋白條帶。對可能的條帶進行酶解，并應用質譜分析及蛋白質數(shù)據(jù)庫比對鑒定蛋白。通過RT-PCR及Western blot判斷發(fā)現(xiàn)的蛋白及COX-2在四種結腸癌細胞中的表達情況。在LoVo細胞中，通過轉染技術應用siRNA敲低該鑒定出的蛋白表達水平，并共轉染COX-2啟動子驅動的熒光素酶報告基因，進而驗證該鑒定出的蛋白對COX-2啟動子區(qū)的特異性結合作用及敲低該蛋白對COX-2啟動子區(qū)激活的抑制作用。在上

17、述共轉染體系中，通過LPS誘導COX-2表達，進而驗證COX-2誘導劑是否可以拮抗敲低該蛋白對COX-2啟動子區(qū)激活的抑制作用。在LoVo及RKO細胞中，應用免疫熒光定位實驗確定該鑒定的蛋白是否位于細胞核，進一步驗證該鑒定的蛋白是否在COX-2轉錄過程中扮演轉錄因子角色。在LoVo及RKO細胞中，通過siRNA敲低該蛋白表達，通過質粒轉染上調該蛋白表達，并應用Western blot鑒定COX-2蛋白表達變化，進一步驗證該蛋白對COX-

18、2蛋白表達的影響。
　　結果：
　　1.生物素-鏈霉親和素垂釣實驗分離出COX-2啟動子區(qū)特異性結合蛋白復合物，經SDS-PAGE及銀染發(fā)現(xiàn)分子量約90kD的蛋白條帶。質譜分析及蛋白質數(shù)據(jù)庫比對鑒定出該蛋白為XRCC5。
　　2. RT-PCR及Western blot提示四種結腸癌細胞系中XRCC5及COX-2在轉錄水平及蛋白水平均呈高表達。
　　3.在LoVo細胞中，敲低XRCC5表達明顯降低其對COX-2啟

19、動子區(qū)的激活作用。COX-2誘導劑LPS拮抗敲低XRCC5表達對COX-2啟動子區(qū)激活的抑制作用。
　　4.在LoVo及RKO細胞中，應用免疫熒光定位實驗確定XRCC5位于細胞核。5.在蛋白表達水平，敲低XRCC5明顯降低COX-2蛋白表達水平，而上調XRCC5表達明顯升高COX-2蛋白表達水平。XRCC5對COX-2表達具有正調控作用。
　　結論：在結腸癌細胞中，XRCC5是特異性的COX-2啟動子區(qū)結合蛋白；XRCC5與

20、COX-2啟動子區(qū)結合可以激活COX-2啟動子，并促進COX-2轉錄。結腸癌細胞中XRCC5在轉錄水平及蛋白水平均呈高表達，XRCC5是結直腸癌的促癌因子。XRCC5在蛋白水平對COX-2具有調控作用，且該調控作用為正向調控。
　　第二部分轉錄共活化子p300通過乙?；疿RCC5協(xié)同調控結腸癌細胞中COX-2表達
　　目的：
　　通過免疫共沉淀方法探討XRCC5與轉錄共活化子p300是否存在相互作用。通過調控p300在

21、結腸癌細胞中的水平及其乙?；δ?，進一步明確p300是否通過乙?；疿RCC5協(xié)同調控COX2表達。
　　方法：
　　提取RKO、LoVo及SW480結腸癌細胞核蛋白，應用XRCC5抗體進行免疫共沉淀，分離出含有XRCC5的免疫復合物，應用Western blot檢測p300抗體是否與該免疫復合物結合。同時，應用p300抗體進行免疫共沉淀，分離出含有p300的免疫復合物，應用Western blot檢測XRCC5抗體是否與該免

22、疫復合物結合。通過上述實驗驗證XRCC5蛋白與p300蛋白是否存在相互作用。應用免疫熒光定位實驗確定XRCC5與p300是否位于細胞核同一位置，進一步驗證兩者的相關性。通過Western blot檢測RKO、LoVo及SW480結腸癌細胞核蛋白乙?；疿RCC5表達情況。通過轉染p300過表達質粒上調p300表達，利用p300乙酰化酶抑制劑C646抑制p300乙?；饔?。而后，應用乙?；贵w免疫共沉淀核蛋白，利用Western blot檢

23、測該免疫復合物中XRCC5及乙酰化XRCC5的表達，驗證P300對XRCC5乙酰化的作用。對結腸癌細胞上調p300表達或應用C646抑制p300乙?；饔?，Western blot檢測COX-2表達情況，驗證p300乙酰化XRCC5對COX-2表達的調控作用。
　　結果：
　　1.應用XRCC5抗體進行免疫共沉淀得到的免疫復合物可以檢測到p300蛋白。而應用p300抗體進行免疫共沉淀得到的免疫復合物可以檢測到XRCC5蛋白。

24、
　　2.免疫熒光定位實驗表明，XRCC5蛋白與p300蛋白均在結腸癌細胞核內表達，兩者位置一致。
　　3. RKO、LoVo及SW480結腸癌細胞核蛋白中均存在大量的乙?；疿RCC5表達。上調p300表達并不增加XRCC5表達，但可以增加XRCC5乙酰化水平，而抑制p300乙?；饔脛t降低XRCC5乙酰化水平。上調p300表達可以增加COX-2表達，而抑制p300乙?；饔脛t降低COX-2表達。
　　結論：
　

25、　XRCC5與轉錄共活化子p300在結腸癌細胞核內存在相互作用，p300通過乙?；疿RCC5協(xié)同調控結腸癌細胞COX-2表達。
　　第三部分XRCC5及p300協(xié)同調控COX-2表達促進結腸癌細胞增殖及腫瘤生長
　　目的：
　　通過細胞增殖實驗及動物成瘤實驗探討XRCC5調控COX-2促進結腸癌生長的作用。通過調控XRCC5及p300乙?；δ?，驗證XRCC5及p300協(xié)同調控COX-2并影響結腸癌細胞增殖的作用。

26、r>　　方法：
　　在 LoVo及RKO細胞中，通過siRNA敲低XRCC5表達，應用MTS方法鑒定結腸癌細胞活力，應用克隆形成實驗鑒定結腸癌細胞增殖能力，通過顯微鏡觀察細胞形態(tài)學變化，研究敲低XRCC5表達對結腸癌細胞生長的影響。通過轉染XRCC5過表達質粒上調XRCC5表達，采用MTS方法鑒定結腸癌細胞活力，明確上調XRCC5對結腸癌細胞生長的作用。在 LoVo及RKO細胞中，通過轉染XRCC5過表達質粒上調XRCC5表達，應

27、用MTS方法判定結腸癌細胞活力，證明XRCC5對結腸癌生長的促進作用。而后，應用COX-2抑制劑塞來昔布抑制COX-2表達，通過MTS實驗鑒定結腸癌細胞活力，明確COX-2抑制劑是否具有拮抗XRCC5促進結腸癌生長的作用，進而在體外驗證XRCC5通過調控COX-2影響結腸癌生長。應用裸鼠成瘤實驗，研究siRNA敲低XRCC5表達對結腸癌在裸鼠體內生長的抑制作用，并觀察COX-2誘導劑LPS是否可以拮抗該抑制作用，進而在動物中驗證XRCC

28、5通過調控COX-2影響結腸癌生長。上調結腸癌細胞p300表達，應用MTS觀察結腸癌細胞活力，驗證p300對結腸癌細胞生長的促進作用。同時上調p300表達和敲低XRCC5表達，應用MTS觀察結腸癌細胞活力，研究敲低XRCC5拮抗p300的促進結腸癌細胞生長的作用，證明p300通過XRCC5影響結腸癌細胞生長。同時抑制p300乙酰化作用和上調XRCC5表達，應用MTS觀察結腸癌細胞活力，驗證p300乙?；种苿┺卓筙RCC5促進結腸癌細胞

29、生長的作用，證明p300通過乙酰化XRCC5促進結腸癌細胞生長。
　　結果：
　　1. MTS實驗表明，通過siRNA敲低XRCC5表達可以明顯抑制結腸癌細胞活力，而轉染XRCC5過表達質粒上調XRCC5表達可以明顯增加結腸癌細胞活力。
　　2.顯微鏡細胞形態(tài)學觀察表明，經siRNA敲低XRCC5表達后，結腸癌細胞貼壁減少，細胞碎片增多?？寺⌒纬蓪嶒灡砻?，通過siRNA敲低XRCC5表達可以明顯降低結腸癌細胞克隆形成能

30、力。
　　3.轉染XRCC5過表達質?？梢源龠M結腸癌細胞生長，COX-2抑制劑塞來昔布可以拮抗XRCC5促進結腸癌生長的作用，這在體外證明了XRCC5通過COX-2促進結腸癌細胞生長。
　　4.裸鼠成瘤實驗表明，siRNA敲低XRCC5表達可以抑制結腸癌生長，而應用COX-2誘導劑LPS可以拮抗該抑制作用，這在體內證明了XRCC5通過COX-2促進結腸癌生長。
　　5.上調p300表達明顯促進結腸癌細胞生長。敲低XRC

31、C5可以拮抗p300促進結腸癌細胞生長的作用。抑制p300乙酰化作用同樣可以在一定程度上拮抗XRCC5的促進結腸癌細胞生長的作用。這表明p300通過乙?；疿RCC5促進結腸癌細胞生長。
　　結論：
　　體內實驗及體外實驗表明，XRCC5通過COX-2促進結腸癌生長。而p300則通過乙?；疿RCC5促進結腸癌細胞生長。p300通過對XRCC5的乙酰化作用與XRCC5協(xié)同調控COX-2表達，進而影響結腸癌生長。我們的實驗結果為X