1、目的：
　　 1. 研究人乳頭瘤病毒（human papillomavirus，HPV）感染與食管癌（esophagealcarcinoma，EC）發(fā)生的相關性：檢測我國不同區(qū)域EC 患者癌組織中HPV 感染率及其型別，了解我國不同區(qū)域EC 組織中HPV 型別分布特性；檢測HPV16 E2/E6基因比率，分析EC 樣品中HPV16的整合狀態(tài)；檢測HPV 整合在染色體的位置，以及通過對我國已發(fā)表的有關HPV 與EC相關文獻的Met

2、a分析，探討HPV 感染與我國EC發(fā)生的病因學關系。
　　 2. 研究EB 病毒（Epstein-Barr virus，EBV）感染與胃癌發(fā)生的相關性：通過對PubMed數(shù)據(jù)庫中的有關EB 病毒（Epstein-Barr virus，EBV）與胃癌相關文獻的Meta分析，探討EBV 感染與胃癌發(fā)生的相關性；構建攜帶EBV 編碼BARF1基因的真核表達載體，為今后建立EBV 感染體外模型奠定基礎，以便進一步探討EBV 感染與胃癌發(fā)

3、生的病因學關系。
　　 方法:
　　 1. 應用HPV L1基因區(qū)通用引物PGMY09/11和GP5+/6+，進行巢式聚合酶鏈反應（nested polymerase chain reaction，NPCR）；應用HPV（包括HPV16、HPV18）E6-E7基因保守區(qū)的簡并引物，及HPV16 E6、HPV18 E6 型特異引物進行巢式多重聚合酶鏈反應（nested multiplex Polymerase chain

4、reaction，NMPCR)，檢測EC組織中HPV16和HPV18兩型別；分析我國不同區(qū)域EC 標本中HPV 感染狀況。
　　 2. 應用HPV16 E2和E6 引物進行實時熒光PCR 擴增，檢測HPV16 E2 與E6的含量，通過E2 與E6的比率，確定HPV 整合狀態(tài)；用β-actin 引物進行熒光PCR 擴增，檢測每一樣品中β-actin 含量，通過HPV16E6 與β-actin 之比，估算HPV16的病毒載量。

5、>　　 3. Oligo(dT)17-P3 引物反轉錄PCR 擴增cDNA的第一鏈，HPV E7 特異P1 forward與P3 reverse 引物第一輪擴增，HPV E7 特異P2 forward 與Oligo(dT)17-P3 reverse 引物第二輪擴增，將第二輪產物連接到pMD-18T 載體，進行測序分析，分析HPV 整合在人染色體的位置。
　　 4. 確定文獻選擇與剔除標準后，以HPV和食管癌為關鍵詞，在國內萬方

6、網(wǎng)和中國知網(wǎng)，檢索有關HPV 與食管癌相關的研究論文，依據(jù)Cochrane 系統(tǒng)，按照Mantel–Haenszel方法，對文獻數(shù)據(jù)作出異質性檢驗，應用隨即效應模型，計算各項研究文獻中食管癌病例組和正常對照組中HPV的優(yōu)勢比（odds ratio，OR）、權重（weight）、95％可信區(qū)間（95％CI）及合并后的權重和95％CI。數(shù)據(jù)處理采用Review Manager 4.2 軟件完成，以P＜0.05 為差異有顯著性。進一步驗證HP

7、V在我國食管癌發(fā)生中的病原學作用。
　　 5. 確定文獻選擇與剔除標準后，以EBV和胃癌為關鍵詞，在PubMed 數(shù)據(jù)庫中，檢索有關EBV 與胃癌相關的研究論文，依據(jù)Cochrane 系統(tǒng)，按照Mantel–Haenszel 方法，對文獻數(shù)據(jù)作出異質性檢驗，應用隨機效應模型，計算各項研究文獻中EBV相關胃癌與臨床病理特征的優(yōu)勢比（odds ratio，OR）、權重（weight）、95％可信區(qū)間（95％CI）及合并后的權重和95

8、％CI。數(shù)據(jù)處理采用Review Manager 4.2 軟件完成，以P＜0.05 為差異有顯著性。進一步驗證EBV在胃癌發(fā)生中的病原學作用。
　　 6. 根據(jù)GenBank 提供的cDNA 序列，設計特異性引物，構建BARF1基因的真核表達載體。
　　 結果：
　　 1. 從收集的食管癌患者標本中檢測HPV 感染的陽性率：河南省林州市為93.2％（109/117）；河北保定市為88.1％（37/42）；四川省鹽

9、亭市為95％（19/20）。它們主要以HPV16 型出現(xiàn)，其次是HPV18 型：HPV16 型陽性率分別占59.6％（65/109）、51.4％（19/37）
　　 和57.9％（11/19）；HPV18 型分別占陽性率的19.3％（21/109）、21.6％（8/37）和21.1％（4/19）。
　　 2. 熒光PCR 結果顯示：32例HPV16E6 陽性標本中，檢測到6.3％（2/32）為純游離型、84.3％（27/

10、32）為游離/整合的混合型、9.4％（3/32）為完全整合型，說明病毒DNA 與宿主基因組整合很普遍；這些標本的病毒載量大約在0.066-65.2 拷貝/細胞之間。
　　 3.序列分析結果顯示，有兩位HPV18 陽性的食管癌患者，其HPV18 整合于患者5號染色體上。
　　 4. 入選17 篇文獻食管癌組織標本HPV 檢出率為44.0％，正常對照組織HPV 檢出率為16.7％，食管癌組織中HPV 感染率與正常對照組織相比

11、具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；
　　 有12 篇文獻進行了HPV16 型特異性檢測，其結果顯示，食管癌組織標本中HPV16 占38.6％，正常組織標本中HPV16 占15.9％，HPV16 感染率與正常對照組織相比具有顯著性差異（P＜0.05）。被檢標本分布在河南、廣東、新疆、四川、河北、上海、福建和香港八個區(qū)域，其HPV 感染與地域分布存在顯著性差異（P＜0.05）。
　　 5. 22 篇入選文獻中收集的胃癌病例54

12、75例，檢測到EBV 陽性病例411例。在EBV陽性胃癌中，男性檢出率為11.1％，女性檢出率為3.0％；EBV 陽性胃癌與陰性胃癌相比具有較少的淋巴結轉移；殘胃癌中EBV 感染率為28.3％；EBV 感染與組織學分型及標本類型無顯著相關性（p＞0.05）。
　　 6. 以兩端添加酶切位點的特異性引物，進行PCR 擴增，得到與預期目的基因片段大小相符的666bp的片段；克隆至載體后，經(jīng)雙酶切和測序分析，確認BARF1基因已正確連

13、接到pcDNA3.1(+)-his 真核表達載體。
　　 結論：
　　 1. 河南省林州市、河北省保定市及四川省鹽亭市食管癌樣品中，HPV 檢出率分別為93.2％、88.1％和95.0％，平均陽性率為92.2％；其中，HPV16和HPV18 兩型別平均檢出率分別為53.1％和18.4％，說明HPV16和HPV18 兩型別在我國具有較高的分布頻率。提示HPV16和HPV18 兩型別可能在食管癌發(fā)生中具有普遍意義。
　

14、　 2. HPV16 陽性食管癌樣品中，病毒DNA 與宿主基因整合很普遍，提示HPV 感染可能是食管癌發(fā)生的重要病原因子。
　　 3. 部分HPV18 可能整合在人5 號染色體，推測HPV基因組在宿主細胞染色體上整合后，形成HPV 持續(xù)性感染，是細胞轉化及癌變的關鍵。
　　 4. Meta分析顯示，我國食管癌組織中HPV 感染與正常組織相比具有顯著性差異（p＜0.05），并且高危型HPV 感染在不同地域普遍存在。這些結

15、果進一步證實高危型HPV感染是食管癌發(fā)生的重要病原因子。
　　 5. EBV 感染僅發(fā)生在癌組織細胞中，并且與患者性別、淋巴結轉移、癌組織發(fā)生部位顯著相關（p＜0.05），與患者癌組織學分型、標本類型無顯著相關性（p＞0.05）；提示，EBV 陽性胃癌具有獨特的臨床病理學特征，EBV 感染與部分胃癌的發(fā)生密切相關。
　　 6. 成功地構建了真核表達載體pcDNA3.1(+)/BARF1-his，為今后建立EBV相關胃癌研